瘦素受體基因Gln223Arg多態性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關系

李 瑩，孫玉鴻，王英敏，隋洪玉，李雅江，斗 章，高英英，徐 輝＊

（佳木斯大學1.附屬第一醫院；2.基礎醫學院；3.《黑龍江醫藥科學》編輯部，黑龍江佳木斯154002）

瘦素受體基因Gln223Arg多態性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關系

李 瑩1，孫玉鴻1，王英敏3，隋洪玉2，李雅江1，斗 章1，高英英1，徐 輝2＊

（佳木斯大學1.附屬第一醫院；2.基礎醫學院；3.《黑龍江醫藥科學》編輯部，黑龍江佳木斯154002）

目的探討瘦素受體基因Gln223Arg多態性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關系。方法 采用聚合酶鏈反應及限制性片段長度多態性方法（PCR－RFLP）分別測定126例2型糖尿病、108例2型糖尿病合并慢性腎功衰竭和185例對照組樣本的瘦素受體基因Gln223Arg的基因型，同時檢測各組不同基因型樣本的血清瘦素水平。結果 2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組與正常對照組瘦素受體基因Gln223Arg基因型頻率及等位基因頻率比較差異有顯著性（P＜0.01）。糖尿病組與正常對照組瘦素受體基因Gln223Arg基因型及等位基因分布頻率差異顯著性（P＜0.05）。2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組中GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較差異有顯著性（P＜0.05）。相同基因型樣本的血清瘦素水平組間比較，任意兩組比較均有差異（P＜0.05）。結論 瘦素受體基因Gln223Arg多態性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭相關。

2型糖尿病；慢性腎功衰竭；瘦素；Gln223Arg；遺傳學

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1670）

作為一種常見的內分泌代謝性疾病，2型糖尿病（T2DM：Type 2Diabetes Mellitus）近10年來，發病率逐年增高，也是一種世界范圍的流行病［1］。我國DM發病率呈逐年上升趨勢，DM引起腎臟的損害是2型DM患者的主要并發癥。糖尿病腎病是糖尿病患者死亡的主要原因之一［2］。本研究應用分子生物學技術對2型DM及2型DM合并慢性腎功能衰竭患者瘦素（lep）受體基因Gln223Arg的多態性進行分析，旨在探討瘦素系統在糖尿病合并腎功衰竭發生、發展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

所有病例來源于2012年1月至2012年12月在我院腎內科、內分泌科收住院的2型DM及2型DM合并慢性腎功能衰竭患者，均無血緣關系，其中2型DM男性81例，女性45例，平均年齡50.7± 6.2歲；2型DM合并慢性腎功能衰竭患者男性74例，女性34例，平均年齡55.7±3.4歲。對照組為本院同時期健康體檢者，平均年齡42.5±2.9歲；經臨床體檢及實驗室檢查，排除心、肝、腎、腦等器質性病變以及高血壓、糖尿病、各種炎癥、腫瘤以及免疫性疾病，且糖耐量正常者，男性104例，女性81例，平均年齡47.8±3.2歲，其年齡、性別方面均與病例組無明顯差別（P＞0.05）。

1.2 實驗方法

受試者夜間禁食12小時，晨起抽取外周靜脈血2ml，經EDTA抗凝離心得白細胞，－80℃低溫保存，待用。常規用苯酚－氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA。參考Richert L［3］等所采用的引物序列，并經過引物設計軟件優化設計引物，引物序列如下：上游：5’－ACC CTT TAA GCT GGG TGT CCC AAA TGA－3＇，下游：5’－AGC TAG CAA ATA TTT TTG TAA GCA ATT－3＇。PCR反應擴增產物長度為416bp，以限制性內切酶MspI（New England Biolabs）在37℃酶解PCR產物4h，電泳后觀察結果。上述采血時同時抽取靜脈血3ml，等待血液凝固后通過離心法提取血清并放置在－70℃低溫冰箱中待檢，最后測定采用放射免疫分析法進行。

1.3 統計學分析

用Hardy Weinberg遺傳平衡定律確認各亞型基因頻率已達遺傳平衡具有群體代表性。采用SPSS12.0（Statistical Product and Service Solutions）統計分析軟件對數據進行處理，用ˉx±s來表示數據，采用F檢驗或t檢驗進行組內比較，當P＜0.05時，表示有統計學意義，兩個分類變量的關聯性分析采用卡方檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR－RFLP檢測

紫外透視儀觀察結果顯示有3種帶型：基因型為AA時，酶切后為416bp一條帶；GG型酶切后為293bp、123bp兩條帶；AG型酶切后為416bp、293 bp、123bp三條帶（見圖1）。

2.2 基因型分布頻率與瘦素受體等位基因之間的關系

如表1所示，Gln223Arg的基因型及等位基因分布頻率在糖尿病組與正常對照組比較有統計學意義，P＜0.01，AA＋AG及GG基因型分布頻率正常對照組與糖尿病合并腎功衰竭組比較具有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 糖尿病合并腎功衰竭組、糖尿病組及正常對照組不同瘦素受體基因型血清瘦素水平比較見表2。

2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較有差異，t＝2.189，P＝0.031，P＜0.05。2型糖尿病組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較有差異，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.01。對照組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較無差異，t＝1.477，P＝0.142＞0.05。

2.4 糖尿病合并腎功衰竭組、糖尿病組及正常對照組，三組相同瘦素受體Gln223Arg基因型血清瘦素（leptin）水平比較見表3。

分別從GG、AA＋AG基因型瘦素水平兩兩比較結果，三組中的任意兩組比較均有差異，有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 瘦素受體基因Gln223Arg多態性電泳結果

表1 Gln223Arg基因型和等位基因頻率分布

表2 瘦素受體Gln223Arg不同基因型血清瘦素（leptin）水平比較（ng／ml，ˉx±s）

表3 三組相同瘦素受體Gln223Arg基因型血清瘦素水平比較（ng／ml，ˉx±s）

3 討論

病程在10－20年的T2DM病人中超過50%有蛋白尿現象，腎臟發生腎小球硬化等特異性病理改變，如腎小管空泡變性、腎臟入球和出球小動脈硬化等。該病的病程嚴重程度幾乎與糖尿病病程平行。這種糖尿病患者所特有的腎小球硬化與腎小球病變在醫學上我們稱為糖尿病性腎病［4，5］。由于該病患者造成腎功能衰竭者據國外有關資料表明比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［6，7］。經國外多項研究結果證明肥胖是2型DM發病的獨立危險因素，尤其是腹型肥胖最為顯著［8］。1994年，Zhang等利用定位克隆技術首次成功克隆出了小鼠的肥胖基因（ob基因）以及我們人類的同源基因序列，使人們認識到了瘦素（Leptin，lep）作為ob基因的蛋白產物的化學分子結構和生理作用［9］，lep是肥胖基因編碼，由脂肪細胞分泌的前激素蛋白［10］。lep為肥胖基因的蛋白產物，是主要由脂肪組織分泌的激素。最初發現它具有控制食欲和促進能量消耗的作用，lep通過與中樞神經系統及周圍器官的瘦素受體直接結合來調節體內的能量平衡、脂肪代謝及某些內分泌功能［11］。近年來研究發現它還具有調節炎癥反應、活化巨噬細胞、促進血管生成、促成纖維細胞生長、膠原合成等功能，與炎癥性結腸疾病、惡性腫瘤、骨骼疾病、哮喘等疾病有密切關系［12］。瘦素受體（LEPR）是新近克隆的基因，目前LEPR基因存在多種多態性，這種多態性主要由于LEPR基因的核苷酸變異［13］，研究較多的變異有Gln223Arg、Lys109Arg、Lay656Asn等，這些多態性與肥胖、糖尿病、惡性腫瘤、骨質疏松、慢性阻塞性疾病等有一定相關性［3，14，15］。目前國內外學者對瘦素受體Gln223Arg基因多態性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭研究甚少。本研究表明：①2型糖尿病合并慢性腎功衰竭患者A、G等位基因分布頻率為0.36和0.64，和2型糖尿病組0.20和0.80及正常對照組0.14和0.86比較有統計學意義（P＜0.001），上述等位基因多態可能與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭有關。②不同基因型血清瘦素水平比較，2型糖尿病組合并腎功衰竭及2型糖尿病組中，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素比較均有差異，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.05。對照組GG基因型與AA＋AG基因型無差異，t＝1.477，P＝0.142 P＞0.05。表明基因多態與瘦素水平有關，進一步表明A等位基因可能是2型糖尿病及2型糖尿病合并腎功衰竭的易感基因。③對于相同瘦素受體Gln223Arg基因型檢測瘦素水平對比，2型糖尿病合并腎功衰竭、2型糖尿病、正常對照組間瘦素濃度具有顯著差異（P＜0.05），血清瘦素濃度在2型糖尿病合并腎衰患者顯著高于2型糖尿病患者及正常對照組，2型糖尿病患者高于對照組，提示糖尿病患者存在高瘦素血癥，隨著腎臟功能的減低，腎臟清除瘦素能力減低，血清瘦素水平逐漸增高，進一步證明腎功能不全時，腎小球濾過功能減低或腎小管降解功能下降，導致腎臟清除瘦素的能力減低，過高的血清瘦素還會在腎組織中集聚，進一步使腎臟損傷［6］。我們的數據表明，瘦素受體基因Gln223Arg多態性與2型糖尿病合并腎功衰竭的發生顯著相關。同時，我們發現，瘦素受體Gln223Arg多態性與2型糖尿病患者及其合并腎功衰竭患者血漿瘦素濃度存在關聯。本研究從基因水平初步分析了瘦素受體基因在2型糖尿病合并慢性腎功衰竭的發生過程可能發揮作用，這為今后治療糖尿病腎病提供了新思路。全面分析瘦素受體基因在2型糖尿病合并慢性腎功衰竭發生的作用機制，尚需進一步的大樣本的研究來證實。

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Relationship between polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg and type 2 diabetes mellitus with chronic renal fail－ure

LI Ying，SUN Yu－hong，WANG Ying－min，et al.
（First Afficiated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China）

ObjectiveTo investigate the relationship of polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.Methods By using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP），we respectively measured leptin receptor gene Gln223Arg in 126cases of type 2diabetes mellitus patients，108cases of type 2diabetes mellitus with chronic renal failure and 185patients with control group sample，Simultaneously detected leptin levels in each genotype samples.Results The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between 108cases of type 2diabetes mellitus and renal failure with normal control groups，P＜0.01，The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between patients with type 2diabetes mellitus without renal failure and controls，P＜0.05.There are significant difference between GG genotype and AA＋AG genotype in type 2diabetes mellitus with chronic renal failure group in serum leptin levels，P＜0.05.Compared with three identical leptin receptor Gln223Arg gene of serum leptin levels，compared results Separately from the GG，AA＋AG genotype of serum leptin levels.Comparison of any two sets，there are significant difference in type 2diabetes mellitus with renal failure，type 2 diabetes without renal failure and normal control group，P＜0.05.Conclusion Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene is associated with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.

type 2diabetes；chronic renal failure；serum leptin；Gln223Arg gene variation；Genetics

R587.1

A

李瑩（1977－），女，黑龍江佳木斯人，副主任醫師，碩士研究生。

2014－11－25）

1007－4287（2015）10－1670－04

本課題為佳木斯大學課題（S2009－053）

＊通訊作者