系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CXCL13及其受體CXCR5表達(dá)水平的研究

謝聞悅，聶李平，楊媛慧

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518036）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CXCL13及其受體CXCR5表達(dá)水平的研究

謝聞悅，聶李平，楊媛慧

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518036）

目的檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者血清趨化因子CXCL13水平及其受體CXCR5在外周血B細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞（TFH）上的表達(dá)，分析CXCL13、TFH細(xì)胞水平與疾病活動(dòng)的相關(guān)性，探討CXCL13及CXCR5受體在SLE發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)58例SLE患者血漿CXCL13水平，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)24例SLE患者外周血中CXCR5在CD19＋B細(xì)胞、TFH細(xì)胞上的表達(dá)水平。結(jié)果 ①血清CXCL13SLE患者組為365.96±216.02（pg／ml），高于健康對(duì)照組145.66±207.25（pg／ml）（P＜0.01）與SLE緩解組167.19±145.37（pg／ml）；CXCL13水平與SLE患者的SLEDAI評(píng)分、抗核抗體滴度呈正相關(guān)（P＜0.05）。②SLE患者B細(xì)胞CXCR5的表達(dá)率為79.03±20.59%，顯著低于健康對(duì)照組94.25±4.52%，P＜0.05。③：SLE活動(dòng)組TFH細(xì)胞水平（%）15.36±7.01高于健康對(duì)照組8.92±5.11%，P＜0.05；TFH細(xì)胞水平與患者的SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05），與C3、dsDNA無相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)論 SLE患者外周血CXCL13及表達(dá)其受體CXCR5的TFH細(xì)胞水平增高，并與病情的活動(dòng)性相關(guān)，提示CXCL13有可能積極參與至SLE的發(fā)病機(jī)制中，并更有可能為SLE的治療提供新的靶點(diǎn)。

紅斑狼瘡；系統(tǒng)性；趨化因子CXCL13；受體CXCR5

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1689）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫病的原型，發(fā)病機(jī)制尚不明確，高度活化的T、B淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是其主要的免疫特征之一。CXCL13又名B淋巴細(xì)胞趨化因子，屬于CXC趨化因子家族，與其受體CXCR5一同在B淋巴細(xì)胞遷移、尋靶和誘導(dǎo)次級(jí)淋巴組織中生發(fā)中心的形成中有著重要作用［1］。研究顯示，CXCR5不僅表達(dá)于B細(xì)胞表面，還是濾泡輔助T細(xì)胞（TFH）表面的重要標(biāo)志。這決定了TFH細(xì)胞的定位和功能，在淋巴濾泡中CXCL13的趨化下，被募集到淋巴濾泡并與B細(xì)胞共定位且輔助B細(xì)胞的增殖與活化，促進(jìn)Ig同型轉(zhuǎn)換和漿細(xì)胞分化［2，3］。本文通過測(cè)定SLE患者血清CXCL13及其CXCR5在外周血B細(xì)胞、TFH細(xì)胞上的表達(dá)水平，探討CXCL13及其受體CXCR5在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 血清CXCL13檢測(cè)的研究對(duì)象 收集2011年11月至2012年10月于我院風(fēng)濕免疫科住院SLE患者58例，所有患者均符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)院（ACR）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。按SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）分為活動(dòng)組（≥5分）和穩(wěn)定組（＜5分）?；顒?dòng)組23例，男性1例，女性22例，平均（30±7）歲；緩解組35例，男性3例，女性32例，平均年齡（33±10）歲。健康對(duì)照組22例，男性3例，女性19例，平均（26±5）歲，無自身免疫性疾病史。

1.1.2 外周血細(xì)胞CXCR5表達(dá)的研究對(duì)象 選取2011年11月至2012年5月于我院風(fēng)濕免疫科住院SLE患者24例，男2例，女22例，平均年齡（30±13）歲。所有患者均符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)院（ACR）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組15例，男4例，女11例，平均年齡（31±12）歲，無自身免疫性疾病史。檢測(cè)外周血CD4＋CXCR5＋T細(xì)胞（TFH）水平以及CXCR5＋在B細(xì)胞（CD19＋）上的表達(dá)。

1.2 主要儀器和試劑 FITC－CD4單抗、ECD－CD3單抗和ECD－CD19單抗購自美國Beckman公司，PE－CXCR5單抗購自美國R＆D公司，流式細(xì)胞儀型號(hào)為美國Beckman公司EPICS XL－4。CXCL13水平檢測(cè)試劑盒購自美國R＆D公司?？购丝贵w（ANA）檢測(cè)試劑盒、雙鏈DN A（dsDNA）抗體試劑盒為歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司產(chǎn)品；、補(bǔ)體C3試劑與儀器均為美國Beckman公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TFH細(xì)胞、B細(xì)胞表面CXCR5表達(dá)水平 取EDTA抗凝外周血標(biāo)本50 μl 3管，分別加入陰性對(duì)照抗體、CD5－FITC／CXCR5－PE／CD19－ECD抗體和CD4－FITC／CXCR5－PE／CD3－ECD抗體，每種抗體各加10μl。4℃避光孵育30min后，加入250μl溶血?jiǎng)┦覝胤胖?0 min，鞘液離心洗滌去上清后，500μl鞘液重懸，用流式細(xì)胞儀按常規(guī)操作進(jìn)行檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用其配套軟件分析。

1.3.2 CXCL13、dsDNA水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 ANA檢測(cè)采用間接熒光免疫法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果判斷為顯微鏡下觀察熒光模型及滴度，以滴度大于或者等于1∶100為ANA檢測(cè)陽性。補(bǔ)體C3采用透射比濁法檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13的水平及CXCL13與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)間的相關(guān)性 SLE患者活動(dòng)組CXCL13水平為365.96±216.02（pg／ml），高于健康對(duì)照組145.66 ±207.25（pg／ml）（P＜0.01）；SLE穩(wěn)定組CXCL13水平為167.19±145.37（pg／ml），與健康對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）見圖1。進(jìn)一步分析SLE患者血清CXCL13水平，發(fā)現(xiàn)11（19%）例狼瘡腎炎患者的CXCL13水平為329.8±236.1（pg／ml），高于47例非狼瘡腎炎患者201.98± 172.03（pg／ml）；對(duì)58例SLE患者CXCL13水平患者的SLEDA I評(píng)分、抗核抗體（ANA）、雙鏈DNA抗體（dsDNA）、補(bǔ)體C3水平的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，CXCL13水平與患者的SLEDAI評(píng)分、抗核抗體滴度呈正相關(guān)（P＜0.05），與C3、dsDAN無相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

表1 CXCL13與SLEDAI、dsDAN、ANA、C3的相關(guān)性

2.2 CXCR5在外周血TFH細(xì)胞、B細(xì)胞上的表達(dá)2.2.1 CXCR5在B細(xì)胞上的表達(dá) SLE患者B細(xì)胞CXCR5的表達(dá)率（%）為79.03±20.59，顯著低于健康對(duì)照組B細(xì)胞CXCR5的表達(dá)率94.25± 4.52，P＜0.05，結(jié)果見圖2。

2.2.2 外周血CD4＋CXCR5＋T細(xì)胞（TFH）的水平 SLE患者組TFH細(xì)胞水平（%）15.36±7.01，健康對(duì)照組為8.92±5.11，P＜0.05（見圖3）；TFH與患者的SLEDA I評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05），與C3、dsDNA無相關(guān)性（均P＞0.05），見表2。

圖1 SLE組與正常對(duì)照組間CXCL13的比較（SLE活動(dòng)組與正常對(duì)照組，P＜0.05）

圖2 SLE組與正常對(duì)照組間B細(xì)胞上CXCR5的表達(dá)（SLE組與正常對(duì)照組，P＜0.05）

圖3 外周血SLE組與正常對(duì)照組間TFH細(xì)胞水平的比較（SLE組與正常對(duì)照組，P＜0.05）

表2 TFH細(xì)胞水平與SLEDAI、dsDAN、C3的相關(guān)性

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，為多種因素相互作用，導(dǎo)致免疫紊亂，B細(xì)胞異常被認(rèn)為是SLE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，可能參與狼瘡疾病的整個(gè)過程，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［4］。趨化因子CXCL13在吸引B細(xì)胞遷移，有效誘導(dǎo)外周器官二級(jí)淋巴組織的形成中起著重要作用［1，5］。在多個(gè)以B細(xì)胞異常增生與活化為特征的疾病研究中發(fā)現(xiàn)的CXCL13升高與疾病的活動(dòng)性相關(guān)，推測(cè)CXCL13可能與疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)［6，7］。Ishikawa等是最早將SLE與CXCL13聯(lián)系一起的，他們發(fā)現(xiàn)高齡狼瘡腎炎BWF1小鼠的胸腺和腎臟中的CXCL13表達(dá)顯著增加，認(rèn)為CXCL13可誘導(dǎo)受損器官中異位淋巴組織的形成以及炎性細(xì)胞的聚集［8］。本研究顯示SLE活動(dòng)組病人的CXCL13明顯高于健康組與SLE穩(wěn)定組，并與疾病活動(dòng)指數(shù)SLEDAI呈正相關(guān)，這與Schiffer和Ezzat等人結(jié)果相一致［9，10］，說明CXCL13與SLE的疾病活動(dòng)相關(guān)，可作為SLE疾病活動(dòng)期的穩(wěn)定標(biāo)志。然而Schiffer等人發(fā)現(xiàn)CXCL13在炎癥反應(yīng)尤其是敗血癥中會(huì)顯著升高，故而提示CXCL13不能用于區(qū)分重度的炎癥反應(yīng)和自身免疫病活動(dòng)期［11］。狼瘡腎炎（LN）是SLE常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，腎內(nèi)B細(xì)胞的增殖和聚集導(dǎo)致腎臟的炎癥與疾病的進(jìn)展，而B細(xì)胞的聚集區(qū)域可出現(xiàn)CXCL13水平的升高和CXCL13mRNA表達(dá)的增強(qiáng)［12］。Ezzat等人報(bào)道LN患兒血清CXCL13水平較無腎臟疾病的SLE患兒顯著升高，且與腎臟的損害程度相關(guān)［10］。進(jìn)一步分析本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11（19%）例狼瘡腎炎患者CXCL13水平遠(yuǎn)高于非狼瘡腎炎患者，這提示CXCL13還有可能成為腎臟損傷程度的指標(biāo)。Worthmann的研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CXCL13表達(dá)定位于腎小球，誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，參與腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)理，推測(cè)CXCL13作為治療靶點(diǎn)的可能［12］。

B細(xì)胞異常被認(rèn)為是SLE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，活化的B細(xì)胞在T細(xì)胞的輔助下產(chǎn)生致病性的自身抗體導(dǎo)致組織損傷，并通過分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)，使自身免疫狀態(tài)持續(xù)存在。CXCR5作為趨化因子CXCL13的特異性受體，主要分布在所有的外周成熟B細(xì)胞表面。我們的結(jié)果顯示，SLE病人組B細(xì)胞上的CXCR5表達(dá)明顯低于健康組，這可能與SLE患者CXCL13水平顯著升高，持續(xù)性誘導(dǎo)外周血表達(dá)CXCR5＋B細(xì)胞歸巢進(jìn)入淋巴濾泡，進(jìn)而導(dǎo)致B細(xì)胞上CXCR5的表達(dá)下降相關(guān)［13］。Maiko等人推測(cè)，丟失CXCR5的病理性B細(xì)胞借助濾泡輔助T細(xì)胞（TFH）的介導(dǎo)產(chǎn)生病理性自身抗體，獲得記憶B細(xì)胞的效應(yīng)功能參與到SLE的疾病進(jìn)程中［14］。

TFH是目前研究的熱點(diǎn)之一，也是最主要的效應(yīng)輔助T細(xì)胞，主要定位于淋巴器官中的濾泡區(qū)。其表面除標(biāo)志性表達(dá)趨化因子受體CXCR5，還表達(dá)BCL－6，PD－1，ICOS等表面分子。主要功能是在CXCL13的誘導(dǎo)下遷移進(jìn)入生發(fā)中心與B細(xì)胞接觸，輔助進(jìn)行B細(xì)胞選擇和協(xié)助其分化為記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞，進(jìn)而參與SLE的發(fā)病機(jī)制中。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血CD4＋CXCR5＋的TFH細(xì)胞比例升高，并與SLEDAI、漿細(xì)胞、自身抗體dsDNA等指標(biāo)顯著相關(guān)［15，16］。Chio［15］等人認(rèn)為TFH與疾病的活動(dòng)性相關(guān)表明T－B細(xì)間相互作用的異常平衡是參與SLE的發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵。Xu［16］等人發(fā)現(xiàn)CD4＋CXCR5＋T細(xì)胞較CD4＋CXCR5－T細(xì)胞能幫助B細(xì)胞產(chǎn)生更多IgG，以抗CD40L阻斷T－B細(xì)胞間相互作用可降低抗體的產(chǎn)生。與文獻(xiàn)報(bào)道相同的是我們也發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血TFH比例顯著高于健康對(duì)照組，并SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)，但與dsDNA等指標(biāo)無相關(guān)性。我們認(rèn)為SLE是高度異質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)多種多樣，即使是發(fā)病年齡不同的患者，臨床特征和發(fā)病機(jī)制也可能存在差異。如果研究中選擇SLE患者樣本有差異，或者還存在藥物治療、感染等混雜因素的影響，就可能出現(xiàn)研究偏差，繼而造成研究結(jié)果的差異。

吳鳳霞［17］等人報(bào)道CXCL13水平與環(huán)磷酰胺及羥氯喹等免疫抑制劑用量呈顯著性正相關(guān)，抗－CXCL13治療可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎及降低淋巴組織的濾泡反應(yīng)［18］。俞寧［19］等發(fā)現(xiàn)經(jīng)地塞米松治療一周后，SLE病人的TFH細(xì)胞可逐漸降低，Meraouna［20］發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可以抑制CXCL13的產(chǎn)生進(jìn)而影響生發(fā)中心B細(xì)胞的數(shù)量和遷移，減少生發(fā)中心的形成，CXCL13有可能為治療提供新的靶向分子。

綜上所述，SLE患者外周血CXCL13及表達(dá)其受體CXCR5的TFH細(xì)胞水平增高，并與病情的活動(dòng)性相關(guān)，這些都提示CXCL13有可能積極參與至SLE的發(fā)病機(jī)制中，并更有可能為SLE的治療提供新的靶點(diǎn)。

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The study of circulating CXCL13level and expression of its receptor CXCR5 with system lupus erythematosus

XIE Wen－yue，NIE Li－ping，YANG Yuan－h(huán)ui.
（Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen518036，China）

ObjectiveTo detect the s levels of chemokine CXCL13and the expression of receptor CXCR5on CD19＋B cell and CD4＋Th cells in patients with systemic lupus erythematosus（SLE），to access the relationship between CXCL13、TFH and SLE disease activity.Methods The serum levels of CXCL13were measured by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）in 58patients with SLE and frequencies of CD19＋CXCR5Bcells and CD4CXCR5Tcell w ere analyzed b y flow－cytometry in 24patients with SLE.Results ①Serum CXCL13concentration was significantly higher in SLE active patients than inactive SLE group and NC group（P＜0.05）；Increase in CXCL13concentration correlated positively and significantly with SLEDAI，Anti－nuclear antibody titers（all P＜0.05）.②the frequencies of CXCR5on CD19＋B cell were significantly down regulated in SLE patients whiling comparing with NC group.③The percentage of CXCR5in CD4＋T cells was increased jn patients with SLE compared with healthy controls，P＜0.05.There were positive co－relationship between TFH and SLEDAI.Conclusion Elevated CXCL13level and increased frequency of circulating Tfh cells in SLE patients are associated with disease activity，indicating CXCL13and its receptor CXCR5may play an important role in the pathogenesis of SLE.

Lupus erythematosus；systemic；chemohine CXCL13；receptor CXCR5

R593.2

A

謝聞悅（1974－），女，碩士，主管技師，主要從事臨床免疫學(xué)工作。

2014－12－05）

1007－4287（2015）10－1689－04

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203031）