先天性心臟病與血管內皮生長因子－634G＞C的相關性研究

楊明遠，徐 光，王玉妍

（1.長春市兒童醫院心胸外科，吉林長春130051；2.吉林大學第一醫院感染科；3.吉林大學中日聯誼醫院）

先天性心臟病與血管內皮生長因子－634G＞C的相關性研究

楊明遠1，徐 光2，王玉妍3＊

（1.長春市兒童醫院心胸外科，吉林長春130051；2.吉林大學第一醫院感染科；3.吉林大學中日聯誼醫院）

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是先天性畸形中最常見的一類，約占各種先天畸形的28%，它是指在胚胎發育時期由于心臟及大血管的形成障礙或發育異常而引起的解剖結構異常，或出生后應自動關閉的通道未能閉合（在胎兒屬正常）的情形。先天性心臟病發病原因很多，以遺傳因素和環境因素為主。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生［1］。本研究通過檢測血清中血管內皮生長因子基因多態性位點－634G＞C的單核苷酸多態性，探討先天性心臟病與血管內皮生長因子－634G＞C基因型的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病例組為長春市兒童醫院心外科收治的先天性心臟病患兒77例，其中男41例，女36例，年齡為6月齡－13歲，所有患兒均經過查體、超聲心動圖及手術明確診斷。對照組為長春市兒童醫院門診體檢健康兒童共75例，其中男38例，女37例，年齡為5月齡－12歲，均經過超聲檢查已除外CHD，并且無其他先天性疾病或腫瘤，肝、腎功能均正常。所有對象均為漢族，兩組年齡，性別差異均無顯著性（P＞0.05）。

1.2 排除標準

具有以下一項者為排除病例，①新生兒期嬰兒，卵圓孔未閉及動脈導管未閉存在，因兩者仍有自行閉合的可能，不作為研究樣本；②CHD患兒出現艾森曼格綜合征，肺動脈壓力極高，心內缺損的血流方向發生改變，血流動力學與未出現艾森曼格綜合征的CHD患兒有差異，所以不作為研究樣本；③CHD患兒合并有染色體疾病，如唐氏綜合征，不作為研究樣本。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的提取和擴增 病例組及對照組患兒清晨空腹6小時以上，采集靜脈血2ml，EDTA抗凝管保存，采集后2小時內，離心機3 500轉／分，離心5分鐘，抽出血漿，置2ml離心管中。血細胞及血漿均在－80℃冰凍保存。飽和酚－氯仿法提取DNA。Taqman探針檢測VEGF－634G＞C的單核苷酸多態性。①紫外光／可見光分光光度法測定樣本的DNA含量。②選擇反應體系20μl：2XTaq－Man Master Mix 10μl，40XTaqman SNP Assays 0.5μl，樣本DNA3μl，無核酸酶水6.5μl。③使用7500型實時熒光定量PCR儀，Taqman探針工作：步驟1：初活化50℃2min，步驟2：活化95℃10 min，步驟3：變性95℃15sec：，步驟4：退火／延伸60℃1min，步驟3和步驟4循環40次。④讀取數據及生成結果圖。

1.3.2 統計學方法 用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，對數據進行正態性檢驗，計量資料用x—±s表示。樣本的均數比較，首先檢驗方差齊性，然后采用t檢驗。兩組間比較采用成組χ2檢驗，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 VEGF－634G＞C的基因型

通過單核苷酸多態性檢測，病例組和對照組的基因型有：純合子GG型，雜合子GC型，純合子CC型，見圖1－3。如僅有紅色曲線抬升，綠色曲線水平，基因型為純合子GG型；如紅色曲線和綠色曲線均有抬升，基因型為雜合子GC型；如紅色曲線水平，綠色曲線抬升，基因型為純合子CC型。

2.2 病例組和對照組VEGF－634G＞C等位基因頻率的比較

病例組共有樣本77個，－634G＞C多態性位點等位基因總數為154個，其中G基因103個，C基因51個；對照組共有樣本75個，－634G＞C多態性位點等位基因總數為150個，其中G基因114個，C基因36個。兩組等位基因G／C頻率經χ2檢驗，χ2＝1.55，P＞0.05，差異無顯著性，見表1。

圖1 基因型GG指數圖

圖2 基因型GC指數圖

圖3 基因型CC指數圖

表1 兩組VEGF－634G＞C等位基因比較［n（%）］

2.3 病例組和對照組基因型GG、GC和CC頻率的比較

病例組的基因型為三種，分別為：GG型38例，GC型27例，CC型12例；對照組基因型也為三種，分別為：GG型53例，GC型8例，CC型14例。病例組與對照組三種基因型的分布經χ2檢驗，χ2＝12.16，P＜0.05，差異有顯著性，見表2。

表2 病例組和對照組VEGF－634G＞C基因型分布比較［n（%）］

2.4 VEGF－634G＞C基因型與CHD易感性

比數比（OR）：指病例組中暴露人數與非暴露人數的比值除以對照組中暴露人數與非暴露人數的比值。比數比是反映疾病與暴露之間關聯強度的指標。如果OR＜1，說明疾病的相對危險度低，如果OR＞1，說明疾病的相對危險度高。本研究的病例組和對照組中，VEGF－634G＞C的基因型分為：GG型為91例、GC型35例、CC型26例。其中兩組的GC型所占比例差異性大。GG型OR值為0.4，GC型OR值為4.5，CC型OR值為0.8。這說明在3種基因型中，GC基因型最易導致CHD的發生，它可能是CHD的易感基因型。見表3。

表3 VEGF－634G＞C基因型患CHD的比數比

3 討論

CHD是小兒先天性畸形疾病中最常見的一類，并且也是小兒最常見的心臟病。我國CHD的發生率為6‰－8‰。近些年，CHD的發病率有逐漸上升的趨勢［2］。CHD被認為是一種復雜性狀疾病，它的形成原因主要與下列因素有關：1、遺傳因素（內在因素）：如單基因突變，染色體畸變，多基因病變和先天性代謝紊亂；2、環境因素（外在因素）：孕早期風疹病毒感染，柯薩奇病毒感染，孕期攝取鋰鹽，糖尿病，酗酒，過量輻射，藥物，高齡孕婦，高原地區生活等。VEGF是調節心臟血管生長發育的重要因子之一。VEGF－634G＞C多態性位點的突變，與CHD的形成密切相關［3］。

在本研究中發現，CHD患兒和健康兒童的VEGF－634G＞C的基因型均為三種：GG型，GC型和CC型。雖然兩組的G／C等位基因頻率無差異，但是兩組基因型的分布有明顯差異。其中，GC型在兩組的差異性較大，并且GC型引起CHD的比數比為4.5，其余兩型的比數比均＜1。所以，GC型可能是CHD發病的易感基因型。原因可能是：－634G＞C的不同的基因型其生理活性不同［4］。－634C的生理活性強于－634G。有研究發現，－634C可能會影響內部核糖體進入位點（IRES），使其表達增加。這樣，VEGF的表達發生異常。另外有研究發現，VEGF影響心臟血管發育主要是受到VEGF的特異性受體控制：VEGF受體－1和VEGF受體－2［5］。這兩種受體作用的協同效應，構成了新的血管形成的基礎。VEGF的表達異常，可能與VEGF受體－1和VEGF受體－2結合程度就會有差異，導致內皮細胞的通透性發生變化，VEGF濃度的改變影響了心血管的發育，可能導致CHD的形成［6］。總之，在胚胎期心臟發育階段，VEGF對心臟發育在時間上和空間上有非常準確的調控。一旦多態性位點－634G＞C發生突變，就有可能導致VEGF的表達異常，血中VEGF的濃度發生改變，影響VEGF對于心臟發育的調控，最終導致CHD的出現［7］。

在胚胎期，VEGF－634G＞C的基因突變后，影響了VEGF的表達。但是每個胎兒受到的影響的程度不盡相同，有的胎兒影響程度較輕，VEGF的濃度變化小，或者在正常范圍內［8］。所以，這類的胎兒在發育過程中，心臟的發育仍然會按照正常的胎兒發育，沒有形成CHD。同樣，有的胎兒由于在胚胎時期，VEGF的表達受到的影響較大，VEGF的濃度低于或超過了正常范圍，導致心臟的發育異常，最終形成了CHD［9］。因此，即使VEGF的多態性位點－634G＞C發生了突變，并且產生了易感CHD的基因型，但是也不一定形成CHD。至于VEGF基因突變后的具體的濃度變化，以及濃度變化對胚胎影響程度，有待于進一步研究［10］。

本研究仍有需要完善的地方：實驗中兩組的樣本量小，無法對CHD進行分型研究；實驗樣本采集受到了國籍、地域及種族、環境的限制；VEGF有多個多態性位點。本實驗只是針對－634G＞C這一個位點進行了探討；實驗中的樣本未采集父母的血樣，對評估CHD的遺傳因素可能會有的影響。

本研究僅證明了VEGF－634G＞C的基因型與CHD的形成有相關性。但尚不能據此診斷胎兒是否患有CHD，也未探討針對CHD形成的機制如何進行基因治療。同時，鑒于CHD的形成有多種因素參與，多個基因位點的突變都有可能對CHD的形成機制產生影響［11］。所以，我們下一步可能需要擴大研究范圍，探討多基因變異的相互作用及其影響，在更深層次，更廣區域研究CHD的形成機制以及如何有效的進行基因干預以減少發病率和死亡率。隨著科學技術的發展，研究VEGF和CHD的進程可以與分子生物學，遺傳學，環境學等學科相結合，為CHD的早期診斷及治療提供理論依據和實踐支持。

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2014－11－26）

1007－4287（2015）10－1749－03

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