表面活性劑法檢測高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）的研究

王賢俊

（溫州市維日康生物技術研發(fā)中心，浙江溫州325041）

表面活性劑法檢測高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）的研究

王賢俊

（溫州市維日康生物技術研發(fā)中心，浙江溫州325041）

高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）主要為ApoA1，ApoA1的降低與動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率［1］密切相關，目前在臨床工作中應用較廣的HDL－C測定方法有肝素－錳沉淀法、PTA－Mg2＋法、PEG修飾酶法（PEGME法）［2，3］、PEG／抗體包裹法（IRC法）［46］、抗體免疫分離法（AB法）［6，7］及勻相法等。本文采用勻相法，選擇兩種不同的表面活性劑及多聚陰離子，根據(jù)脂蛋白的酶反應選擇性，直接測定HDL－C的濃度，并與日本第一化學藥品株式會社試劑盒進行對比，對該參考試劑的所有性能指標進行全面分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 參考試劑為高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）檢測試劑盒（溫州市維日康生物科技有限公司）；對比試劑為磷鎢酸鎂法試劑盒（北京中生公司），PEG修飾酶法試劑盒（衛(wèi)生部臨床診斷試劑實驗中心，進口分裝），高密度脂蛋白膽固醇勻相法檢測試劑盒（日本第一化學藥品株式會社）。

1.1.2 儀器 奧林帕斯AU2700全自動生化分析儀和日立7600全自動生化分析儀兩種機型進行實驗，具體方法的操作規(guī)程見文獻［8］。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應完成度 由于本次參考試劑采用的計算方法為終點法，要求反應在盡可能短的時間達到反應終點。所以本次試驗觀察反應曲線在200秒時的反應完成度。取低、中、高三種濃度的血清分別進行測定并記錄反應曲線，觀察反應完成度。HDL－C血清濃度分別為0.51、1.42、3.24mmol／L。

1.2.2 線性范圍 本參考試劑的線性范圍為0.01－3.57mmol／L。每個濃度重復測定3次取平均值，對測定值與預期值作回歸分析。

1.2.3 反應特異性 為了判斷參考試劑對HDL－C反應的特異性，即只于HDL－C反應而不與LDL－C發(fā)生反應。取一份血清（LDL－C 2.18mmol／L、HDL－C 1.47mmol／L）分為500μL 10等份，向其中分別加入0.2μmol，0.35μmol，0.5μmol，0.65 μmol，0.8μmol，0.95μmol，1.05μmol，1.2μmol，1.35μmol，1.5μmol的LDL－C純品，混勻后對10份血清分別進行測定。

1.2.4 回收試驗 分別取0.9ml的5份血清樣本中（濃度分別為0.47mmol／L、0.85mmol／L、1.25mmol／L、1.69mmol／L、2.07mmol／L）加入0.1mL的標準溶液（濃度為3.28mmol／L），每個濃度重復檢測3次，分別測定其回收值并計算回收率。

1.2.5 測量精密度 取低、中、高三份HDL－C濃度的混合血清在相同條件下，用參考試劑分別對三份混合血清進行日內(nèi)和日間重復性試驗，日內(nèi)重復性試驗每份血清重復檢測20次，日間重復性試驗每份血清連續(xù)檢測20天。

1.2.6 干擾試驗 分別取6份1ml的相同血清，其中一份做為對照，其他5份分別加入甘油三酯5.6mg，膽紅素0.2mg，血紅蛋白濃度5.0mg，維生素C 8.0mg，脂肪劑10mg，混勻后用參考試劑進行測定，并記錄實驗結(jié)果。

1.2.7 方法對比試驗 本次試驗血清樣本數(shù)量為50份，其濃度分配為低值占30%，正常值占40%，高值占30%，采取雙份測定樣本，第一次測定為順序，第二次為反向順序測定。將參考試劑與PTAMg2＋法、PEG修飾酶法及日本一化試劑進行比較，測定結(jié)果進行回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 反應完成度 反應曲線圖中300秒處為加入試劑二，加入試劑二后反應正式開始，觀察三個濃度水平的反應曲線可以發(fā)現(xiàn)，從300秒開始至400秒反應基本達到終點，在500秒時已經(jīng)達到反應終點，故參考試劑在200秒內(nèi)反應完成度良好（見圖1）。

2.2 線性范圍 線性相關系數(shù)r2為0.998，表明0.01－3.57mmol／L范圍內(nèi)線性關系良好。結(jié)果如圖2所示。

2.3 反應特異性 如圖3所示，當LDL－C最終濃度達到5.18mmol／L時，本法測出的HDL－C值未升高，表明加入LDL－C不會使HDL－C測定值升高，該試劑盒特異性良好。

圖1 試劑反應曲線

圖2 試劑線性趨勢圖

圖3 特異性反應曲線

2.4 回收試驗 參考試劑回收試驗結(jié)果良好，見下表1。

2.5 精密度 精密度實驗表明，批內(nèi)精密度和批間精密度分別1.32%－1.89%和1.69%－2.15%，結(jié)果見表2。

表1 本法對不同濃度HDL－C標本檢測的回收率

表2 日內(nèi)、日間精密度結(jié)果

2.6 干擾試驗 試驗結(jié)果表明甘油三酯≤8.7 mmol／L，膽紅素≤342μmol／L，血紅蛋白≤5g／L，維生素C≤8g／L，脂肪劑≤10mg／mL對測定結(jié)果沒影響。結(jié)果見表3。

表3 干擾試驗結(jié)果

2.7 方法對比試驗 參考試劑方法與PTA－Mg2＋法、PEG修飾酶法、日本一化法的結(jié)果相關性均良好。參考試劑的結(jié)果（Y）與PTA－Mg2＋法（X1）、PEG修飾酶法（X2）和日本第一化學試劑（X3）相關良好，分別為Y＝0.982 X1＋0.037（r2＝0.9905，n＝50），Y＝0.991 X2＋0.040（r2＝0.9915，n＝50），Y＝0.987 X3＋0.043（r2＝0.9922，n＝50）。對比結(jié)果見圖4、5、6。

圖4 HDL－C直接法與PTA－Mg2＋法的比較

圖5 HDL－C直接法與PEG修飾酶法的比較

圖6 HDL－C直接法與日本一化的比較

3 討論

本次實驗選用的高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）檢測試劑盒（溫州市維日康生物科技有限公司）采用表面活性劑消除法，屬于勻相法，試劑為液體雙試劑。試劑一中的表面活性劑a能改變除HDL以外的脂蛋白結(jié)構(gòu)并解離，解離后的微粒化膽固醇分子被膽固醇酶分解成膽甾烯酮、脂肪酸和H2O2，其中生成的H2O2因缺乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色，此時HDL顆粒仍完整。當加入含有表面活性劑b的試劑二時，能使HDL顆粒解離釋放出膽固醇分子，此時生成的H2O2由于試劑二中含有偶聯(lián)劑DSBmT，所以參與完整Trinder反應而顯色，由于其他脂蛋白解離出的膽固醇分子在前一步反應中已被除去，所以此時顯色產(chǎn)生的吸光度變化多少與樣本中HDL－C含量成比例。

綜上所述，本研究實驗表明了HDL－C表面活性劑直接法檢測試劑反應完成度、線性范圍、特異性、準確度、精密度、抗干擾等性能指標均優(yōu)異。且擁有液體雙試劑穩(wěn)定性好，簡便快速準確的特點，而與參考方法及其國外同類試劑的方法對比實驗表明了它們具有良好的一致性，符合臨床的檢測要求。

［1］van－der Steeg WA，Holme I，Boekholdt SM，et al.High－density lipoprotein cholesterol，high－density lipoprotein particle size，and apolipoprotein A－Ⅰ：significance for cardiorvascular risk［J］.J Am Coll Cardiol，2008，51（6）：634.

［2］Benlian P，Cansier C，Hennache G，et al.Comparison of a new method for the direct and simulraneous assessment of LDL－C and HDL－C with ultracentrifugation and established methods［J］.Clin Chem，2000，46（4）：493.

［3］白書堂，李建麗，郭占軍.高密度脂蛋白膽固醇勻相測定技術進展［J］.齊魯醫(yī)學檢驗，2003，5（14）：1

［4］Harris N，Galpchian V，Rifai N.Three routine metheds for measuring high－density lipoprotein cholesterol compared with the reference method［J］.Clin Chem，1996，42（5）：738.

［5］Nauck M，M?rz W，Haas B，et al.Homogeneous assay for direct determination of high－density lipoprotein cholesterol evaluated［J］.Clin Chem，1996，42（3）：424.

［6］Warnick GR，Nauck M，Rifai N.Evolution of measurement of HDL－cholesterol：from ultracentrifugation to homogeneous assays［J］.Clin Chem，2001，47（9）：1579.

［7］Naucka M，M?rz W，Wieland H.New immunoseparation－based homogeneous assay for High－density lipoprotein cholesterol compared with three homogeneous and two heterogeneous methods for HDL－cholesterol［J］.Clin Chem，1998，44（7）：1443.

［8］葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.第3版.南京：東南大學出版社，2006：485－487.

2015－03－26）

1007－4287（2015）10－1760－03