淫羊藿苷對體外培養骨髓基質細胞成骨性分化的影響

馬小妮,石文貴，謝艷芳，陳克明，馬慧萍，葛寶豐，甄 平，周 建

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·論著·

淫羊藿苷對體外培養骨髓基質細胞成骨性分化的影響

馬小妮,石文貴，謝艷芳，陳克明，馬慧萍，葛寶豐，甄 平，周 建

目的 探討淫羊藿苷(icariin, ICA)在無成骨分化誘導劑存在的條件下對體外培養大鼠骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)成骨性分化的影響。方法 取Wistar大鼠BMSCs，用1×10-5mol/L ICA對BMSCs進行干預，實時定量聚合酶鏈反應(real time-PCR, RT-PCR)檢測Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)和 Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx-2)mRNA的表達水平；蛋白質印跡(Western blot, WB)檢測CollagenⅠ和Runx-2蛋白的表達水平；試劑盒法檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性。結果 1×10-5mol/L ICA能直接提高CollagenⅠ和 Runx-2 mRNA和蛋白表達的BMSCs ALP活性。結論 ICA直接促進大鼠BMSCs成骨性分化，并不依賴地塞米松。

骨髓基質細胞；地塞米松；淫羊藿苷；Runt 相關轉錄因子2；大鼠, Wistar

隨著我國人口日趨老齡化，骨質疏松癥的發病率迅速升高[1-3]。該病主要是由于骨吸收大于骨形成，從而導致骨丟失的一種嚴重威脅中老年人健康的常見病[4-5]。近年來，一些研究顯示，淫羊藿苷(icariin, ICA)具有促進骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)骨形成活性和抑制破骨細胞骨吸收活性的作用。然而，上述研究是在傳統成骨分化誘導劑存在的條件下得出ICA具有促進BMSCs骨形成活性的結論[6-9]。傳統的成骨分化誘導劑的配方為：1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/ml磷酸化維生素 C[10]。其中，β-甘油磷酸鈉和磷酸化維生素C主要促進成骨細胞的礦化[11]，地塞米松對成骨細胞的分化有重要作用[12-13]。我們前期的研究均是在上述誘導劑存在時，發現ICA具有促進BMSCs骨形成活性。為了進一步觀察ICA在無地塞米松誘導時是否仍然具有促進BMSCs骨形成活性的作用，本實驗將 BMSCs培養在只含β-甘油磷酸鈉和磷酸化維生素C的DMEM 培養液中，同時用1×10-5mol/L ICA處理上述BMSCs，分析成骨性相關基因和蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 試劑 無酚紅DMEM培養液，標準胎牛血清(蘭州民海生物公司)，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、地塞米松，無激素胎牛血清(CSFBS, Biowest)，淫羊藿苷(ICA，中國藥品生物制品檢定所，純度>98%)，RNAiso Reagent、反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 大鼠BMSCs的培養 將體重150 g的Wistar雄性大鼠脫頸處死,無菌條件下剝離出股骨和脛骨,剪去兩端骨骺,用12號針頭從一側切口向骨髓腔內注入DMEM培養液,完全沖出骨髓,合并沖出液,用滴管反復吹打,使細胞團塊盡量打散。用150目濾網過濾3次,所得濾液基本為單細胞懸液,進行細胞計數后,調整細胞濃度為1×106個/ml,接種在直徑為60 mm的中皿中。置于37℃、5% CO2培養箱中培養72 h后，棄培養液,PBS洗滌2遍,換用新鮮培養液繼續培養,待細胞融合時進行后續實驗。

1.3 實驗方法及結果判定

1.3.1 加藥處理及分組：將大鼠BMSCs細胞用含10% CSFBS無酚紅DMEM培養液培養24 h后，棄培養液，加入含0或1×10-5mol/L ICA的上述培養液培養24、48和72 h，并將其分成對照組和加藥組。

1.3.2 實時定量-聚合酶鏈反應(real time-PCR, RT-PCR)檢測Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)和 Runt相關轉錄因子2(Runx-2)基因表達：大鼠BMSCs細胞棄去培養液，PBS漂洗兩次。加入1 ml Trizol裂解細胞并收集裂解液，加入200 μl氯仿混勻后室溫放置5 min，4℃ 12 000 r/min，離心15 min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置15 min，4℃ 12 000 r/min,離心10 min。棄上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min,離心5 min。棄上清，加入40 μl無RNA酶雙蒸水(ddH2O)重懸沉淀，-80℃保存備用反轉錄反應制備cDNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit說明書合成cDNA，-20℃保存備用；PCR擴增cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書添加PCR反應體系，進行40個循環擴增目的基因，RT-PCR數據處理采用2-△△Ct法，合成的引物(大連寶生物公司合成)序列，見表1。

1.3.3 蛋白印跡(Western blot, WB)檢測 Collagen-Ⅰ和 Runx-2蛋白表達：將大鼠BMSCs細胞棄去培養液，PBS漂洗兩次，加入200 μl細胞裂解液RIPA，冰上靜置15 min后，收集裂解液，-20℃保存備用，將上述裂解產物反復凍融裂解3次，12 000 r/min離心30 min，按照BCA-200蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，取20 μg蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移至聚偏氟乙烯膜上用封閉液封閉后，分別加入1∶1000的兔抗ALP,Collagen-Ⅰ、Runx-2和1∶1000小鼠抗β-Actin,室溫振蕩2 h，洗滌3次，分別加入1∶10 000與1∶5000辣根過氧化酶標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗室溫孵育1 h,TBST漂洗后,ECL顯色,結果以WB的條帶寬窄比較各組細胞Collagen-Ⅰ和Runx-2相對表達水平。

1.3.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性測定：將BMSCs以1×106個/ml接種于60 mm培養皿，用含10% CSFBS無酚紅培養液培養，3 d換液1次，待細胞融合成片時加入0或1×10-5mol/L ICA培養3、6、9和12 d。按ALP試劑盒說明書操作測定3、6、9和12 d的ALP活性，酶活力以nmol/(15 min·mg)蛋白表示[9]。

2 結果

2.1 Collagen-Ⅰ和Runx-2基因表達 加藥組24、48 h Collagen-ⅠmRNA表達量均高于對照組(P<0.01,P<0.05),兩組72 h表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；加藥組24、48、72 h Runx-2 mRNA的表達均高于對照組(P<0.01),且在48 h達到峰值，之后呈下降趨勢，見表2。

2.2 Collagen-Ⅰ和Runx-2蛋白表達 加藥組Runx-2蛋白表達水平在加藥24和72 h分別為1.671 ±0.132和1.812 ±0.131，對照組為0.806 ±0.164和0.471±0.045，加藥組均高于對照組(P<0.01)；在加藥24和48 h ，加藥組Collagen-Ⅰ蛋白表達水平為0.785± 0.031和1.577± 0.331，對照組為0.280±0.122和0.515±0.087，加藥組均高于對照組(P<0.01)，而兩組在加藥48 hRunx-2蛋白和加藥72 h Collagen-Ⅰ蛋白表達水平差異比較無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.3 ALP活性 與對照組比較，加藥組給予藥物處理3 d時ALP活性差異無統計學意義(P>0.05)；給予藥物處理6、9、12 d加藥組ALP活性均高于對照組(P<0.05，P<0.01)，且在第9天達到峰值，見表3。

表2 兩組大鼠骨髓基質細胞Ⅰ型膠原和Runt相關轉錄因子2基因表達水平比較

注：加藥組為骨髓基質細胞加入1×10-5μmol/L淫羊霍苷處理，對照組未加入淫羊霍苷；與對照組比較，aP<0.05,bP<0.01

表3 兩組大鼠骨髓基質細胞堿性磷酸酶活性的比較

注：與對照組比較，aP<0.05,bP<0.01

圖1 蛋白印跡檢測兩組骨髓基質細胞Runx相關轉錄因子2和Ⅰ型膠原蛋白的表達

3 討論

現有研究顯示，在地塞米松(Dex)存在時，ICA具有促進BMSCs分化的作用[14-15]。于是，我們猜想ICA在沒有Dex時是否具有直接促進BMSCs分化的作用。因此本研究主要探討在沒有地塞米松存在時ICA對體外培養BMSCs Collagen-Ⅰ和Runx-2基因、蛋白表達及ALP活性的影響。試圖尋找一種新的或更強的促體外培養BMSCs成骨性分化的誘導劑，進而為研發治療骨質疏松的新藥提供新思路。

Collagen-Ⅰ在BMSCs成骨性分化過程中表達而且是組成骨基質的主要成分[16]，所以檢測Collagen-Ⅰ的表達可以反映BMSCs成骨性分化的過程。Runx-2是BMSCs成骨性分化的一個關鍵轉錄因子，其能調節成骨性分化的關鍵基因表達[17-18]。ALP是BMSCs成骨性分化早期的標志酶，在骨基質形成過程起了關鍵作用[19]，可代表BMSCs成骨性分化的開始。本研究結果顯示，ICA能在無地塞米松時直接提高BMSCs Collagen-Ⅰ和Runx-2基因、蛋白表達水平及ALP活性。提示ICA可作為一種新的促BMSCs成骨性分化的誘導劑。本研究結果還顯示，ICA對提高成骨性分化的關鍵基因(Runx-2)表達在給藥24、48和72 h均較顯著，在24 h和48 h對Collagen-Ⅰ基因的表達有顯著提高作用，但在給藥72 h，加藥組Collagen-Ⅰ基因表達雖高于對照組，但差異無統計學意義。提示ICA促進BMSCs成骨性分化存在不同的分子機制。

雖然本研究結果顯示了ICA在無Dex的培養基中能直接提高BMSCs Collagen-Ⅰ和Runx-2基因和蛋白表達水平及ALP活性，但具體的作用機制目前仍不十分明了。Hsieh等[20]研究報道ICA通過骨形態發生蛋白及NO信號途徑促進成骨細胞分化及礦化。而我們以往研究提示ICA第八位碳原子上的異戊烯基在其促進體外培養BMSCs成骨性過程中發揮重要作用[21]。然而，關于ICA藥理學作用及分子結構和生理活性的相關性等尚待進一步研究。

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Effect of Icariin on the Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells in Vitro Culture

MA Xiao-nia, SHI Wen-guia, XIE Yan-fanga, CHEN Ke-minga, MA Hui-pingb, GE Bao-fenga, ZHEN Pinga, ZHOU Jiana

(a. Orthopaedics Institute, b. Pharmacy, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To investigate the effect of icariin (ICA) on osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs) without osteogenic induction in vitro culture. Methods BMSCs were isolated from Wistar rats, and were cultured with 1 × 10-5mol/L ICA . The mRNA expressions of Collagen-Ⅰ and Runx-2 (runt-related transcription factor 2) were measured by RT- PCR (realtime polymerase chain reaction). The protein expressions of Collagen-Ⅰ and Runx-2 were measured using Western blot (WB). Alkaline phosphatase (ALP) activity was measured using commercial kit. Results 1 × 10-5mol/L ICA could directly enhance protein expressions of Collagen-Ⅰ and Runx-2 of BMSCs and ALP activity. Conclusion ICA may directly improve osteogenic differentiation of BMSCs without Dexamethasone.

Bone marrow stromal cells; Dexamethasone; Icariin; Runt-related transcription factor 2； Rats, Wistar

國家自然科學基金(81270963)

730050 蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所(馬小妮、石文貴、謝艷芳、陳克明、葛寶豐、甄平、周建)，藥材科(馬慧萍)

陳克明，E-mail: chkeming@aliyun.com

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0016-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.004

2014-06-16 修回時間：2014-11-03)