心鈉素對多發性骨髓瘤細胞增殖及微小RNA-21 表達的影響

吳 霞，丁江華，袁利亞，陳國安

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·論著·

心鈉素對多發性骨髓瘤細胞增殖及微小RNA-21 表達的影響

吳 霞，丁江華*，袁利亞，陳國安

目的 探討心鈉素(ANP)對多發性骨髓瘤(MM)細胞增殖的影響及其抗癌機制。方法 以MM1.S細胞為研究對象，觀察不同濃度ANP對MM細胞增殖與周期的影響，檢測A型利鈉肽受體(NPR-A)與C型利鈉肽受體(NPR-C)蛋白表達，并分析ANP對MM細胞miRNA-21表達的影響。結果 1～100 μmol/L ANP以濃度依賴性抑制MM細胞增殖；其中，在24h時間點ANP對MM1.S細胞增殖抑制作用最強；隨著時間延長，ANP 抑制作用呈減弱趨勢。ANP作用MM1.S細胞24h后，與對照組比較，各組G1期細胞比例均增加，S期與G2期細胞比例下降，PI及miRNA-21表達均低于對照組(P<0.01，P<0.05)。MM1.S細胞上存在NPR-A與NPR-C受體。結論 ANP與NPR-A/C受體結合，通過阻滯細胞周期于G1期與抑制miR-21表達，發揮抗MM細胞增殖作用。

多發性骨髓瘤；心鈉素；細胞增殖；微小RNA-21

近10年，盡管新藥組成的化療方案及自體外周血干細胞移植的應用極大地改善了多發性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)預后，但至今MM仍然不可治愈，且其發病率逐年上升，已超過急性白血病，位居惡性血液病第2位[1]。由于MM患者多為老年人，自身免疫力低下，臟器功能不全，使大劑量化療及骨髓移植受到限制。因此，有必要積極探索對MM治療副作用小、安全有效的新型藥物。心鈉素(ANP)主要參與調節血壓以及維持機體電解質平衡等重要功能。近年來，大量研究發現ANP對多種實體瘤(如小細胞肺癌、胰腺癌等)具有抗癌效應[2]。然而，ANP在MM中的作用如何，目前報道較少。本研究通過觀察ANP對MM細胞增殖的影響，試圖探討ANP在MM中抗腫瘤作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 RPMI-1640培養基、青鏈霉素混合液(雙抗)、胎牛血清(FBS)等購自美國Gibco公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC凋亡試劑購自美國BD Biosciences公司。細胞周期測定試劑盒購自杭州聯科生物公司，A型利鈉肽受體(NPR-A)與C型利鈉肽受體(NPR-C)抗體購自美國Abcam公司，GADPH抗體購自杭州賢至生物公司，二抗(羊抗兔)購自美國EarthOx公司。RNA 提取試劑盒購自德國Qiagen公司，逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR擴增試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 實驗藥物 心鈉素購自美國Sigma-Aldrich公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解ANP，將其配制500 μmol/L的儲存濃度，分裝保存于-20℃。實驗前用PBS緩沖液稀釋到工作濃度。

1.3 細胞培養 MM1.S細胞株為懸浮生長的細胞，具有K-Ras突變，由中國醫學科學院血液病醫院邱錄貴教授惠贈。MM1.S細胞常規培養于含10%FBS、青霉素與鏈霉素組成的完全RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養，每3～4 d傳代1次。所有實驗均取對數生長期細胞。

1.4 實驗分組 根據心鈉素濃度的不同，分成5組：對照組、1 μmol/L組、10 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組。

1.5 實驗方法

1.5.1 CCK-8法檢測細胞增殖：收集細胞后計數，向96孔培養板中分別加入細胞懸液、藥物和培養基，總體積200 μL，每孔細胞數為1×104個，每組ANP濃度分別為0、1、10、50與100 μmol/L；另設只加培養基的空白孔作為空白對照。置細胞于培養箱內分別培養24 h、48 h、72 h后，向每孔加入CCK-8試劑20 μL，混勻后孵育1 h，酶標儀上檢測各孔OD值(A)，實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(給藥組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.5.2 流式細胞儀檢測細胞周期：收集細胞后計數，調整細胞濃度為1×106個/ml。在96孔培養板中依次加入培養基、細胞懸液和藥物，總體積2.5 ml，每孔細胞數為1×106個，各組ANP濃度分別為0、1、10、50與100 μmol/L。置培養箱內孵育24 h后收集細胞，PBS洗滌細胞1次后重懸細胞，再加入預冷的純乙醇2 mL，4℃過夜。離心棄乙醇，室溫下加入2 ml PBS孵育15 min，離心棄上清后加入1 ml試劑A，震蕩10 s混勻，室溫孵育30 min。1 h內在流式細胞儀488 nm激發波長下測定細胞DNA含量，計算細胞增殖指數(PI)。PI=(S期+G2期)/(G1期+S期+G2期)。

1.5.3 蛋白質印跡(Western blot)檢測NPR-A與NPR-C蛋白表達：提取細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移到硝基纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人單克隆抗體NPR-A(1∶5000)與NPR-C(1∶400)，4℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標記的二抗(1∶10,000)，在ChemiDocTM XRS+System(Bio-Rad)中顯影攝像。

1.5.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測miR-21 mRNA表達：逆轉錄引物與PCR引物序列由上海生物工程公司合成。按RNA提取試劑盒說明測定OD260/OD280比值，若比值在1.8～2.0之間說明RNA純度較好，即進行逆轉錄。取各組RNA2 μg，依次加入miR-21與U6逆轉錄特異性引物及逆轉錄反應體系，37℃加熱1 h，即獲得cDNA。配制PCR總反應體系，按預變性(95℃，120 s)、變性(95℃，20 s)、退火(62℃，30 s)及延伸(68℃，45 s)順利進行熒光定量PCR擴增。以U6作為內參，按2-△△Ct方法計算miR-21 mRNA相對表達量(F值)。見表1、2。

表1 逆轉錄引物序列

表2 聚合酶鏈反應引物序列

2 結果

2.1 細胞增殖活性測定 藥物作用24 h時，1 μmol/L組、10 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組MM1.S細胞增殖抑制率呈濃度依賴性遞增(P<0.01)，藥物作用48 h和72 h時，除 10 μmol/L組、50 μmol/L組兩組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組之間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與24 h比較，48 h和72 h時1 μmol/L組、100 μmol/L組MM1.S細胞增殖抑制率均有不同程度降低，呈時間依賴性(P<0.05)，但10 μmol/L、50 μmol/L組24 h時增殖抑制率高于48 h和72 h(P<0.05)，48 h和72 h時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.2 細胞周期檢測 藥物作用24 h后，與對照組比較，1 μmol/L組、10 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組G1期細胞比例均有不同程度的升高，且呈濃度依賴性遞增(P<0.05)；G2期細胞比例均有不同程度的降低，且呈濃度依賴性遞減(P<0.05)；各組PI均顯著低于對照組(P<0.01)，且呈濃度依賴性遞減(P<0.05)；4組S期細胞比例均低于對照組(P<0.05))，4組間比較差異無統計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 心鈉素對MM1.S細胞的增殖抑制率

注：與1 μmol/L組比較，aP<0.05，bP<0.01;與10 μmol/L組比較，cP<0.05，dP<0.01；與50 μmol/L組比較，eP<0.05，fP<0.01;與24 h比較，gP<0.05；與48 h比較，iP<0.05

表4 流式細胞儀檢測心鈉素作用MM1.S細胞24 h后細胞周期的結果

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與1 μmol/L組比較，cP<0.05;與10 μmol/L組比較，eP<0.05；與50 μmol/L組比較，gP<0.05

2.3 NPR-A與NPR-C蛋白檢測 ANP作用24 h后，通過Western blot檢測NPR-A與NPR-C蛋白表達，結果發現在MM1.S細胞上存在NPR-A與NPR-C受體，見圖1。

圖1 MM1.S細胞NPR-A、NPR-C受體表達

ANP為心鈉素，NPR-A為A型利鈉肽受體，NPR-C為C型利鈉肽受體，GADPH為內參照

2.4 miR-21mRNA檢測 ANP作用24 h后，對照組、1 μmol/L組、10 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組miR-21相對表達量分別為1.000±0.000、0.914±0.038、0.758±0.111、0.625±0.034、0.510±0.062。與對照組比較，1 μmol/L組、10 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組miR-21相對表達量均低于對照組，并呈劑量依賴性下降(P<0.01，P<0.05)，其中以50 μmol/L組與100 μmol/L組下降最顯著。

3 討論

ANP是由28個氨基酸組成的多肽，具有強大的降低血壓、擴張血管、利尿及利鈉作用，主要參與機體水、電解質平衡的調節，臨床用于診斷與治療高血壓、心力衰竭等疾病[3-4]。近年來發現ANP對人胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌、前列腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞具有抗癌作用，在這些瘤細胞表面均檢測到NPR-A與NPR-C受體的表達[5-8]。研究顯示：在實體腫瘤細胞中，ANP與NPR-A/NPR-C受體結合后，升高環磷酸鳥苷(CGMP)濃度，抑制細胞內Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路[9]、阻斷有絲分裂原如表皮生長因子(EGF)的活性、抑制AKT活性[10]、選擇性抑制信號傳導與轉錄活化因子3(STAT3)等[11]多種途徑，發揮抑制腫瘤細胞增殖，影響細胞周期，增強癌細胞對藥物的敏感性等作用。更重要的是ANP對正常人前列腺、腎臟與肺組織細胞無抑制作用[12]，提示ANP應用于臨床安全有效，抗瘤譜廣等特點。

然而，關于ANP在血液腫瘤中的作用研究甚少，國外僅1篇文獻報道ANP可能有抗白血病作用[13]。本實驗發現：在藥物作用24 h時，ANP以濃度依賴性抑制骨髓瘤細胞(MM1.S)增殖，100 μmol/L濃度ANP時增殖抑制率達(93.14±1.97)%，與上述文獻中ANP對實體瘤的抗癌效應相一致。隨著作用時間延長，ANP抑制作用有減弱趨勢，分析可能與ANP的半衰期短有關。此外，在MM1.S細胞上檢測到NPR-A與NPR-C受體蛋白表達，提示NPR-A與NPR-C為一種“通用性”受體蛋白[14]，ANP可通過與NPR-A/C結合升高cGMP濃度，從而發揮抗MM細胞增殖作用。

MM細胞存在著明顯的細胞周期分布異常，嚴重影響MM預后。臨床發現MM的S期細胞比例顯著高于正常漿細胞，而且S期細胞比例是MM重要的獨立預后指標之一[15]。本實驗結果顯示：不同濃度ANP作用MM1.S細胞24 h后，與對照組比較，G1期比例增加，S期與G2期比例下降，隨著藥物濃度升高細胞增殖指數下降。提示ANP阻滯MM1.S細胞于G1期，從而抑制骨髓瘤細胞DNA合成，這與ANP在實體瘤中抑制細胞DNA合成的結論是一致的[5-6]?？梢?，應用ANP調節MM細胞周期(特別是S期)分布，可作為MM治療的潛在策略。

miR-21作為原癌基因，是目前唯一發現幾乎在所有腫瘤中均存在過表達的miRNA[16-18]。miR-21的過表達導致多種信號通路異常激活，包括Ras-MEK1/2-ERK1/2、PI3K/AKT等，而這些通路正好與MM的發生密切相關[19-20]。臨床發現miR-21在MM患者骨髓單個核細胞中表達明顯高于正常對照組，復發/難治MM患者中miR-21表達高于初治組，化療有效者miR-21表達明顯降低，化療無效或進展者組miR-21無明顯變化[21]。上調miR-21可導致MM對馬法蘭產生耐藥，而miR-21表達下調可增加MM細胞對地塞米松及阿霉素的敏感性[22-23]，表明miR-21參與MM發病、進展及耐藥發生。研究表明miR-21抑制劑在體內具有抗MM作用[24]。本實驗發現，ANP處理后，MM1.S細胞miR-21的表達明顯下調，提示ANP可以通過下調miR-21表達發揮抗MM細胞增殖作用。

綜上所述，ANP在心力衰竭患者中，循環中的水平可增加至正常的10～40倍，患者各項生理指標依然可以保持相對正常，即使在正常生理條件下ANP 的水平可隨著年齡的增加而升高[25-26]。與傳統化療藥物相比，ANP無骨髓抑制、肝腎功能損害等不良反應，安全性好。目前ANP作為藥物已被用于心力衰竭、高血壓等疾病的治療。Ueda等[27]報道應用ANP成功治療2例原發性腎病綜合征引起的急性腎損傷，提示ANP有助于改善腎功能。由于MM患者多為老年人，臟器功能不全，且MM本身即可引起腎功能衰竭，ANP對于MM患者無疑是一種潛在的治療新藥物。

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Effects of Atrial Natriuretic Peptide on the Proliferation of Myeloma Cells and microRNA-21 Expression

WU Xia1, DING Jiang-hua1,2, YUAN Li-ya3, CHEN Guo-an1

(1. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China; 2. Department of Hematology and Oncology, 171 Hospital of the PLA, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 3. Hematology Institution, Academy of Medical Science of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China)

Objective To explore the effects of Atrial Natriuretic Peptide (ANP) on cell proliferation of multiple myeloma (MM) and its anticancer mechanisms. Methods The MM1.S cells were used in this study, and the effects of different concentrations of ANP on cell proliferation and cell cycle were observed. The protein expressions of natriuretic peptide receptor-A (NPR-A) and NPR-C were detected, and the effect of ANP on microRNA-21 (miR-21) expression in MM1.S cells were also analyzed. Results The 1-100 μmol/L ANP inhibited the MM cell proliferation in a dose-dependent manner; at the 24thh, ANP had the most potent anti-proliferative activity against MM cells, and then anti-proliferative activity became weaker and weaker with time went by. After ANP affected MM1.S cells for 24 h, compared with those in control group, the cell ratios in G1 phase were increased, while the cell ratios in S and G2 phases were decreased, and the expressions of proliferation index (PI) and miRNA were lower than those in control group (P<0.01,P<0.05). The NPR-A and NPR-C receptors were found in MM1.S cells. Conclusion ANP in combination of NPR-A/C receptor has anti-proliferative effect in MM cells by blocking cell cycle in G1 phase and inhibiting the miR-21 expression.

Multiple myeloma; Atrial natriuretic factor; Cell proliferation; microRNA-21

國家自然科學基金(81460037)；江西省自然科學基金(20122BAB205022)

330006 南昌，南昌大學第一附屬醫院血液科(吳霞，陳國安);332000 江西 九江,解放軍171醫院血液腫瘤科(丁江華)；330006 南昌，江西省醫學科學研究院血液研究所(袁利亞)

袁利亞，E-mail: yly405@126.com

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0045-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.011

2014-12-20 修回時間：2015-01-20)

*為共同第一作者