逍遙簍貝散聯合順鉑對乳腺癌細胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齊澤華，韓 濤，劉軍靈，郭 放，馬東初，韓雅玲，劉兆喆，謝曉冬

?

中醫藥研究

·論著·

逍遙簍貝散聯合順鉑對乳腺癌細胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齊澤華，韓 濤*，劉軍靈，郭 放，馬東初，韓雅玲，劉兆喆，謝曉冬

目的 比較逍遙簍貝散聯合順鉑與單藥順鉑對乳腺癌細胞成瘤能力的影響及并分析逍遙簍貝散是否能減少順鉑的不良反應，期望為臨床應用中藥逍遙簍貝散聯合順鉑治療乳腺癌提供基礎實驗依據。方法 建立乳腺癌細胞系MCF-7荷瘤小鼠模型，將12只裸鼠隨機分成3組，每組4只。以腫瘤生長情況和抑瘤率為指標，觀察各組藥物對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用；以小鼠的一般情況、血清肌酐、尿素氮為指標，觀察聯合用藥是否能減少順鉑治療的不良反應。結果 逍遙簍貝散聯合順鉑組與單藥順鉑組對乳腺癌細胞系MCF-7成瘤能力均有不同程度的抑制作用，逍遙簍貝散聯合順鉑組和單藥順鉑組腫瘤體積較對照組顯著減少(P<0.01)，逍遙簍貝散聯合順鉑組荷瘤小鼠一般情況好于單藥順鉑組，并且肌酐、尿素氮水平低于單藥順鉑組(P<0.05)。結論 逍遙簍貝散具有抗腫瘤作用，與順鉑聯合使用，在增加抑瘤作用的同時，可一定程度減少順鉑的不良反應。

逍遙簍貝散；順鉑；乳腺腫瘤；大鼠,裸

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，占女性全部惡性腫瘤的22%，是危害女性健康的重要疾病[1]。乳腺癌曾在中國等發展中國家低發，然而隨著社會經濟環境等諸多因素的發展，乳腺癌的發病率在世界范圍內迅速增加，僅僅10年時間乳腺癌的總體發病率提高了10倍[2]，在中國乳腺癌更以每年2.7%的比例快速增長[3]。目前乳腺癌的治療仍然以手術切除為主，并且術后輔助化療及內分泌治療也成為乳腺癌的重要治療方法，但作為我國千年傳承的中醫中藥在乳腺癌治療中的作用往往為人們所忽視，越來越多的證據提示，中醫藥治療可以顯著改善乳腺癌的治療效果，極大改善乳腺癌患者的進展及預后，為乳腺癌患者的治療提供了新的選擇[4-5]。

順鉑是較常用的一種化療藥物，具有抗癌譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協同作用且無交叉耐藥等特點，為當前聯合化療中常用的藥物之一，常用于晚期乳腺癌的治療[6]，但是乳腺癌對順鉑為主的化療具有相對不敏感性，且治療后易復發轉移，導致預后不良[6]。逍遙簍貝散具有疏肝健脾，行氣散結的雙重功效。現代藥理研究證實，中藥逍遙簍貝散中的特定組分能促進淋巴母細胞轉化，抑制腫瘤生長，對細胞免疫和體液免疫均有一定促進作用[7]，且與某些化療藥聯合應用，在療效上顯現協同作用，并能減輕化療藥的不良反應，有重要的抗腫瘤活性[8-9]。目前，逍遙簍貝散聯合順鉑對乳腺癌細胞在裸鼠體內成瘤能力的抑制作用報道較少，本研究擬比較逍遙簍貝散聯合順鉑與單藥應用順鉑對乳腺癌細胞成瘤能力的抑制作用，并分析逍遙簍貝散是否能減少順鉑的毒副作用，期望為臨床應用中藥逍遙簍貝散聯合順鉑治療乳腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 清潔級裸鼠12只，體重20～30 g，6周齡，購于上海中科院實驗動物中心。乳腺癌細胞株(MCF-7)為本實驗室自備。逍遙簍貝散散劑(購自沈陽中醫院藥局)，組分：柴胡、當歸、白芍、茯苓、貝母、法半夏、制南星各10 g,生牡蠣30 g,白術12 g,瓜蔞、山慈菇各15 g；注射用順鉑凍干型(齊魯制藥有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌細胞MCF-7培養：含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，種植于10 cm培養皿中，待細胞生長至80%左右時，0.5%胰蛋白酶消化，用生理鹽水重懸后800 rpm離心除去胰酶，用臺盼藍進行細胞計數。取對數生長期MCF-7細胞2×105個，用100 μl生理鹽水混勻于Ep管中，吹打至單細胞懸液，備裸鼠荷瘤用。

1.2.2 MCF-7荷瘤小鼠模型的制備：將小鼠逐只稱重記錄并隨機分為逍遙簍貝散聯合順鉑組、順鉑單藥組、對照組3組，每組各4只。無菌條件下，在每只小鼠右后肢皮下注射已經準備好的乳腺癌單細胞懸液2×105個，制作裸鼠皮下荷瘤模型。

1.2.3 給藥：接種第3天開始給藥。對照組給予生理鹽水100 μl/次瘤周注射，隔日1次；順鉑組給予順鉑2 mg/(kg·次)瘤周注射，隔日1次；順鉑聯合逍遙簍貝散組除給予順鉑2 mg/(kg·次)隔日瘤周注射外，同時給予逍遙簍貝散按50 mg/(kg·次)劑量灌胃，隔日1次；共給藥21 d后停藥，繼續觀察至第8周。期間常規飼養，每日觀察荷瘤小鼠活動能力、進食及瘤體變化情況。

1.2.4 腫瘤體積測量：每周測量腫瘤直徑(d)，至第8周對荷瘤小鼠行脫臼處死，計算小鼠荷瘤體積(V=1/2d3)。抑瘤率=對照組腫瘤體積-用藥組腫瘤體積/對照組腫瘤體積。

1.2.5 肌酐、尿素氮水平測定：處死荷瘤小鼠時摘取眼球采血，室溫靜置2 h左右后，3000 r/min，5min離心取上層血清。送檢驗科分別測定尿素氮、肌酐水平。

2 結果

2.1 荷瘤小鼠腫瘤體積和抑瘤率 逍遙簍貝散聯合順鉑組、順鉑單藥組和對照組荷瘤小鼠腫瘤體積分別為(0.249±0.157)、(0.469±0.142)、(1.266±0.361)cm3，逍遙簍貝散聯合順鉑組及順鉑單藥組腫瘤體積均較對照組明顯減少(P<0.01)，逍遙簍貝散聯合順鉑組腫瘤體積較順鉑單藥組減少(P<0.05)；逍遙簍貝散聯合順鉑組、順鉑單藥組抑瘤率分別為(59.84±17.59)%和(76.89±17.51)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 荷瘤小鼠一般情況、肌酐、尿素氮水平 實驗過程中觀察荷瘤小鼠，對照組無裸鼠死亡，但隨著瘤體增大活動量逐漸減少且消瘦，毛色晦暗干枯。順鉑單藥組裸鼠用藥開始時活動明顯減少，消瘦較為明顯，毛色干枯，但瘤體增長較慢，至第3周時死亡1只裸鼠，治療后期(第6周～第8周)剩余3只裸鼠狀態有所好轉，活動量增加，瘤體增長較慢。逍遙簍貝散聯合順鉑組小鼠一般情況好于上述兩組，無裸鼠死亡，活動能力較上述兩組改善，略有消瘦，瘤體增長緩慢。

逍遙簍貝散聯合順鉑組、順鉑單藥組和對照組荷瘤小鼠肌酐水平分別為(60.448±2.752)、(72.303±3.475)、(25.986±0.789)mmol/L，尿素氮分別為(9.862±0.634)、(13.66±2.333)、(6.438±0.171)mmol/L，逍遙簍貝散聯合順鉑組和單藥順鉑組的肌酐、尿素氮水平均高于對照組，但逍遙簍貝散聯合順鉑組肌酐、尿素氮水平低于單藥順鉑組(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌的發生發展是多因素參與并相互作用的結果，涉及環境、飲食、生育和激素失衡等諸多原因，而相關資料顯示，遺傳易感性和機體內環境的失調及紊亂在乳腺癌的發生發展過程中起到了重要作用[10-14]。傳統的乳腺癌治療手段以手術切除為主，術后的輔助化療及內分泌治療也成為乳腺癌的重要治療方法，這些方法使早期乳腺癌的治療取得了較好的療效，但對于晚期乳腺癌的療效并不理想，近些年來隨著抗癌藥物的不斷研發，晚期乳腺癌患者多采用多藥聯合、不同途徑給藥等化學治療方法，以期患者生存期有所延長，但同時，多藥聯合化療嚴重不良反應也在一定程度上影響著患者的生活質量，因此找到一種既可以調控機體整體免疫狀態，改善機體內環境紊亂，又可以協同化療藥物抑瘤作用，減輕化療藥物不良反應的輔助藥物成為研究人員所亟須解決的難題。隨著循證醫學的發展，作為我國千年傳承的中醫中藥在乳腺癌治療中逐漸進入人們的視野，越來越多的證據表明，強調整體辨證論治的中醫藥療法可以顯著改善乳腺癌的治療效果，極大改善乳腺癌患者的不良反應，提高乳腺癌患者的生活質量，為乳腺癌患者治療方式提供了新的選擇[15]。

中醫對乳腺癌病機的認識多歸結于肝氣郁結，脾失健運，乳房為陽明經所司，乳頭為厥陰經肝所屬，若平素性情不暢肝失調達，郁久則氣血瘀滯，糾結日久，積聚于乳房可發為乳腺癌[16]，這與現代醫學所認為的乳腺癌是一種全身性疾病不謀而合。而中醫藥治療乳腺癌又有著悠久歷史，其所強調的“整體觀念，辨證論治”的疏肝解郁法始終貫穿于乳腺癌整個治療進程中[17]。中藥逍遙簍貝散最早見于《太平惠民和劑局方》，主治肝郁痰凝之乳癖、乳巖、瘰疬等證。具有疏肝健脾，行氣散結的雙重功效，其方中主要成分為柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓，甘草[18-19]。據文獻報道[17]，柴胡、當歸、白芍疏肝解郁，養血柔肝；白術、茯苓、甘草補脾益腎，燥濕和中。現代藥理研究亦證實，白芍能促進淋巴母細胞轉化，抑制腫瘤生長，對細胞免疫及體液免疫均有一定促進作用，白術降低癌細胞的增值率，減低瘤組織的侵襲性，提高機體抗腫瘤反應能力及對抗瘤細胞的細胞毒性作用。當歸多糖與某些化療藥聯合應用，在療效上顯現協同作用，并能減輕化療藥的副作用，有重要的抗腫瘤活性。茯苓多糖激活局部補體使腫瘤臨近區域被激活的補體通過影響巨噬細胞，淋巴細胞或其他細胞及體液因子，從而協同殺傷腫瘤細胞，為1種可增強人體免疫功能的多糖物質[20]。柴胡多糖能提高小鼠體液和細胞免疫功能，并使免疫抑制狀態有一定程度的恢復，有幫助腫瘤患者恢復食欲的功效。諸藥合用，具有疏肝健脾，行氣散結功效。然而作為中華瑰寶的中藥逍遙簍貝散在現代腫瘤治療中卻往往為人所忽視，本研究聚焦于中藥逍遙簍貝散聯合順鉑對乳腺癌荷瘤小鼠的體內抑瘤效果研究，具有一定的創新性和臨床轉化研究價值。

本實驗以荷瘤裸鼠為動物模型，首先觀察了順鉑單藥、逍遙簍貝散聯合順鉑對乳腺癌細胞系MCF-7成瘤能力的影響，實驗結果顯示，逍遙簍貝散聯合順鉑組及順鉑單藥組腫瘤體積均較對照組明顯減少，表明逍遙簍貝散聯合順鉑組和順鉑單藥組成瘤能力明顯低于對照組。逍遙簍貝散聯合順鉑組腫瘤體積低于順鉑單藥組，逍遙簍貝散聯合順鉑組和順鉑單藥組的抑瘤率均>30%，說明兩組均具有一定抗腫瘤作用，且逍遙簍貝散聯合順鉑組應用效果要好于單用順鉑組。其次，實驗中可以觀察到，順鉑組荷瘤裸鼠給藥過程中逐漸出現活動能力降低等與順鉑治療的不良反應有關的表現，而逍遙簍貝散聯合順鉑組裸鼠一般情況要好于順鉑單藥組，檢測逍遙簍貝散聯合順鉑組肌酐、尿素氮水平均低于順鉑單藥組，說明聯合用藥可適當減少順鉑治療產生的不良反應。這一定程度上提示逍遙簍貝散聯合化療藥物治療乳腺癌可增加化療藥物的抗腫瘤效應，減輕化療相關不良反應，提高腫瘤患者生活質量，有一定的臨床應用價值。

綜上所述，通過本研究，從實驗角度證實了作為傳統中醫中藥瑰寶的逍遙簍貝散方劑對化療藥物的增效作用，其主要表現在提高腫瘤的緩解率及改善臨床癥狀，降低化療藥物毒性反應，從而使化療可按時、按劑量、按階段進行，達到增加治療目的，提高生活質量，延長生存期的效果，這也為抗腫瘤新藥的開發和臨床腫瘤治療提供了新的思路和相關理論依據，具有積極的意義。

[1] 王劭宏,谷俊朝.乳腺癌的誤診與防范[J].國際外科學雜志，2007，34(1):69-71.

[2] Pathak R, Giri S, Aryal M R,etal. Mortality, length of stay, and health care costs of febrile neutropenia-related hospitalizations among patients with breast cancer in the United States[J].Support Care Cancer, 2015.

[3] 周霞.乳腺癌篩查行為干預的研究現狀及發展方向[J].蚌埠醫學院學報，2013，38(2):243-246.

[4] 李倩,周劬志.中醫藥治療乳腺癌概況[J].內蒙古中醫藥，2011，30(5):100-101.

[5] 張榮華,李配富.中醫藥治療乳腺癌研究概況[J].現代中西醫結合雜志，2008，17(16):2580-2582.

[6] 張憲生,陸家齊.大劑量順鉑治療晚期乳腺癌(附36例報告)[J].河北醫藥，2002，24(12):941-942.

[7] 張曉君,祝晨蔯,胡黎,等.當歸多糖的免疫活性和對造血功能影響[J].中藥藥理與臨床,2002,18(5):24-25.

[8] 汪蕓,陶移文,田庚元.白芍多糖的制備、理化性質及抗腫瘤活性研究[J].中國現代中藥,2013,15(8):645-649.

[9] 王艷麗,和水祥,羅金燕.柴胡皂苷抗腫瘤機制研究進展[J].中西醫結合學報,2006,4(1):98-100.

[10]許曄瓊.基因多態性與乳腺癌發生發展關系的研究進展[J].中國腫瘤,2012,21(9):676-681.

[11]韓濤,劉兆喆,郭放,等.細胞周期素G1與三陰乳腺癌不良預后關系的研究[J].解放軍醫藥雜志，2014，26(3):17-21.

[12]劉寒強,侯倩,張文斌,等.三羥異黃酮對乳腺癌細胞系MCF-7生長的影響[J].解放軍預防醫學雜志,2006,24(3):164-167.

[13]陳蕾,吳曉,洪超群等.乳腺癌擴增基因1表達與乳腺癌預后的相關性研究[J].中國醫藥導報,2012,9(31):5-7.

[14]馬超慧,呼敏,郝桂琴等.臨床護理路徑對乳腺癌患者護理滿意度及自護能力的影響[J].中國醫藥導報,2013,10(6):136-137.

[15]姜開運,馬驥.中醫藥治療乳腺癌研究集粹[J].中醫藥學刊，2003，21(3):431-432.

[16]韓宜容,韓永生.保元湯加味治療頑固性乳癰40例[J].中外健康文摘，2009，6(24):277.

[17]侯俊明,江靜.疏肝解郁法聯合化療治療乳腺癌臨床療效分析[J].西部中醫藥，2014，(9):1-3.

[18]修春,宓穗卿,王寧生.逍遙散的藥理研究進展[J]. 中國藥房，2007，18(9):702-703.

[19]王曉強,高權國.逍遙散的藥理研究進展[J].中醫藥信，2007，24(1):40-42.

[20]鄭威.茯苓多糖及其修飾物抗腫瘤作用及機制研究進展[J].健康研究，2011，31(5):379-381.

Inhibition Effect of Xiaoyaoloubei Powder in Combination of Cisplatin on Tumor Formation of Breast Cancer Cells in Nude Mice

QI Ze-hua1,2a, HAN Tao2a, LIU Jun-ling2a, GUO Fang2a, MA Dong-chu2b, HAN Ya-ling2c, LIU Zhao-zhe2a, XIE Xiao-dong2a

(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110000, China; a. Department of Oncology, b. Department of Medical Experiments, c. Department of Cardiology, 2. General Hospital of Shenyang Military Area Command, Shenyang 110840, China)

Objective To compare the effect between Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin on anti-cancer therapy, and to analyze whether Xiaoyaoloubei powder can reduce the adverse effects of Cisplatin or not so as to provide basic experiment support for Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin in clinical treatment of breast cancer. Methods Tumor-bearing nude mice models of breast cancer cell line MCF-7 were established, and the 12 nude mice were randomly divided into control group (n=4), Cisplatin group (n=4) and Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group (n=4). The inhibition effects on tumor formation were observed in all groups according to tumor growth and the inhibitory rate as anti-cancer evaluation criterion; the question of whether combined administration could reduce the adverse effects of Cisplatin treatment was also observed according to the general situation of mice, serum creatinine and urea nitrogen as evaluation criterion. Results Both Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin have inhibitory effects on tumor formation of breast cancer cell line MCF-7 in different degrees, and the tumor sizes in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and Cisplatin groups were significantly reduced compared with that in control group (P<0.01); the general status in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group was better than that in Cisplatin group, and the levels of creatinine and urea nitrogen in combined group were decreased compared with those in Cisplatin group (P<0.05). Conclusion Xiaoyaoloubei powder has anti-cancer effect, and in combination of Cisplatin can reduce the adverse reactions of Cisplatin to a certain extent as well as increase the ability of anti-cancer effect.

Xiaoyaoloubei powder; Cisplatin; Breast Neoplasms; Rats, nude

科技部十二五重大新藥創制平臺(2012ZX09303016-002)；2012年遼寧省科技攻關計劃(2012225019)

110000 沈陽,遼寧中醫藥大學(齊澤華)；110840 沈陽，沈陽軍區總醫院腫瘤科(齊澤華、韓濤、劉軍靈、郭放、劉兆喆、謝曉冬)，醫學實驗科(馬東初)，心內科(韓雅玲)

謝曉冬,E-mail：doctor_xxd@163.com；劉兆喆，E-mail：lzz_summer@126.com

R-332

A

2095-140X(2015)03-0090-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.022

2014-11-17 修回時間：2015-01-20)

*為共同第一作者