大鼠脊髓半橫斷損傷后S-100B表達的變化*

鄒 云， 余資江， 林金棠

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

大鼠脊髓半橫斷損傷后S-100B表達的變化*

鄒 云， 余資江**， 林金棠

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

目的： 研究大鼠脊髓半橫斷損傷(SCI)后損傷區域星形膠質源性蛋白(S-100B)的表達情況。方法： 將70只雄性成年SD大鼠隨機分為正常組(10只)、假手術組(10只)及模型組(行T10脊髓右側半切術，術后分為1 d，7 d，14 d，21 d，28 d組，每組各10只)；術后于相應時間點采用BBB及Reuter法行后肢神經功能評分，評分后處死大鼠，對SCI后損傷區域行S-100B免疫組織化學染色，Western blot檢測S-100B蛋白表達，透射電鏡觀察損傷區域的組織形態學變化。結果： (1)BBB與Reuter評分顯示模型組大鼠麻醉清醒后即出現癱瘓及感覺功能障礙，術后7 d神經功能開始好轉，隨著時間的推移，神經功能逐漸恢復，14 d時后肢神經功能恢復最明顯；(2)免疫組織化學顯示正常組及假手術組少量表達S-100B，模型組S-100B表達較正常組及假手術組均增高，S-100B表達在14 d時達到高峰，大量反應性星形膠質細胞增生、肥大，28 d時S-100B表達趨于穩定；(3)Western blot檢測S-100B蛋白表達水平與免疫組織化學結果相一致；(4)電鏡下SCI后損傷區域神經元腫脹，變性，細胞器減少，線粒體水腫，空泡變性。結論： SCI后S-100B表達增高，星形膠質細胞增生，可能與損傷神經的自發修復過程有關。

脊髓損傷; 修復； 神經再生； 星形膠質源性蛋白； 大鼠,Sprague-Dawley

星形膠質源性蛋白(S-100B)是一種酸性的能與鈣、鋅結合的可溶性蛋白，屬于鈣結合蛋白家族[1]。S-100B除在細胞內存在外，也可被星形膠質細胞分泌，發揮重要的生理功能，亦作為中樞神經系統的特異性蛋白受到廣泛重視[2]。脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)時，損傷和壞死的細胞被動釋放大量S-100B，損傷刺激星形膠質細胞活化也可產生S-100B[3-4]，其濃度的變化或可間接反映神經損傷的病理生理過程。本實驗主要研究S-100B與SCI時損傷恢復時間的變化規律，為治療神經損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

兔抗S-100B多克隆抗體、即用型SABC顯色試劑盒、生物素化二抗(羊抗兔IgG)及BCA蛋白定量試劑盒購于武漢博士德生物公司，細胞裂解液(RIPA)、5×蛋白上樣緩沖液購于碧云天生物技術研究所，四甲基乙二胺(TEMED，北京索萊寶生物科技有限公司)，蛋白電泳儀(PowerPae Basic Power supply型) 、垂直電泳槽(Mini-PRoTEAN3型)、轉移電泳槽(Mini Tans-Blot Cell型) 購于美國Bio-RAD公司，RM2016輪轉切片機購于上海徠卡儀器有限公司，自備常規手術器械等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及手術方法 選擇健康成年雄性SD大鼠70只，體重250～300 g，隨機分為正常組(10只，常規飼養)、假手術組(10只，摘除棘突和椎板，不損傷脊髓)及模型組(行T10脊髓右側半切術，術后分為1 d，7 d，14 d，21 d，28 d組，每組各10只)。T10脊髓右側半切術：麻醉后常規消毒鋪巾，俯臥位固定大鼠，定位T10棘突。切開T9～T11皮膚，分離兩側棘突旁肌肉，暴露T9～T11棘突和椎板，固定T10椎板，小號持針器仔細摘除T10棘突、右側椎板至右側關節突，充分暴露手術所需視野，而后定位中線，將尖刀片刀背對著正中溝，刀鋒向右向脊髓內垂直刺入，隨即在與脊髓垂直方向向右側橫行切斷右半側脊髓；仔細止血，青霉素沖洗切口，逐層縫合。假手術組只摘除棘突和椎板，正常組常規分籠飼養。

1.2.2 大鼠后肢神經功能評分 采用BBB[5]法行后肢運動功能評分，Reuter[6]法行感覺功能評分，觀察SCI后后肢功能恢復情況。BBB評分是根據動物髖、膝、踝、趾、前后肢協調運動等情況評定運動功能，分22級，最高21分，最低0分。Reuter評分法是從牽張反射、疼痛回縮反射、背部感覺、肌張力及肌力等5個方面來評定SCI后的感覺變化，最低0分，表示正常，最高11分，表示癱瘓。評分采用雙盲、雙人獨立觀察記錄，最后取平均值。

1.2.3 免疫組織化學檢測S-100B表達 各組取3只大鼠脊髓石蠟包埋后，按照試劑盒說明書檢測S-100B表達，隨機選取6個200倍視野,記錄SCI后不同時間點S-100B平均陽性細胞數。免疫組化步驟簡述如下：3% H2O2滅活內源性過氧化物酶(室溫，10 min)，5%正常山羊血清封閉(37 ℃，20 min)，滴加一抗(S-100B 1∶100)，4 ℃過夜(PBS代替一抗做陰性對照)，次日PBS浸洗3×2 min，滴加二抗(37 ℃，20 min)，SABC反應(37 ℃，20 min)，DAB顯色、脫水、透明、封片。

1.2.4 Western blot檢測S-100B表達 在相應時間點各組隨機取5只大鼠，用乙醚麻醉后在冰上迅速解剖出脊髓，切取以損傷區域為中心約3 cm長度的脊髓節段，標記后投入液氮中保存。快速將液氮中的組織取出，放到研缽中研碎，加入RIPA裂解細胞，離心后分離提取蛋白行Western blot檢測，使用Quantity One對所做實驗圖片進行灰度值的定量分析。

1.2.5 超微結構觀察 在相應時間點各組隨機取2只大鼠，麻醉、灌注后，快速取出損傷脊髓中心1 mm×1 mm×1 mm大小標本，放入2%戊二醛中固定24 h(4 ℃)，透射電鏡觀察并攝片。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠后肢神經功能評分

模型組大鼠麻醉清醒后即出現癱瘓癥狀，感覺功能明顯異常，術后7 d傷側后肢神經功能開始好轉，隨著時間的推移，大鼠后肢功能逐漸恢復，術后14 d時恢復最明顯，BBB評分達8分，Reuter評分恢復至5分以下，見表1。

2.2 S-100B陽性細胞及蛋白表達

免疫組織化學結果顯示，正常脊髓切片中S-100B陽性細胞數量較少，染成棕褐色；模型組術后1 d組，S-100B陽性細胞數量開始增加，主要在星形膠質細胞中表達；7 d組脊髓損傷標本中 S-100B陽性細胞胞體增大，突起增多，染色加深， 14 d組脊髓損傷標本中這種表現更加明顯，21～28 d組，S-100B陽性細胞與14 d比較未見明顯變化，見圖1。平均陽性細胞數量見表2。脊髓損傷后S-100B蛋白的相對表達量較正常組及假手術組皆升高，術后14 d組升高最明顯，術后21～28 d組S-100B表達趨于穩定，見圖2及表2。

組別BBBReuter正常組21.0±0.00 0±0.00假手術組19.0±0.81 0.5±0.54術后1d組 0.0±0.00(1)(2) 10.9±0.54(1)(2) 7d組 3.4±0.51(1)(2) 6.7±0.55(1)(2) 14d組7.8±0.54(1) 4.8±0.21(1)(2) 21d組10.2±0.84(1) 3.7±0.47(1) 28d組12.6±0.55(1) 3.3±0.40(1)

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與術后28 d組比較，P<0.05

注：a為正常組，b為術后1 d組，c為術后7 d組，d為術后14 d組，e為術后21 d組，f為術后28 d組

圖2 各組大鼠S-100 蛋白表達

2.3 透射電鏡觀察

電鏡下，正常脊髓切片中神經元胞膜完整，細胞器豐富，線粒體結構正常，核內染色質分布均勻，核仁清晰；模型組術后1 d組，神經元腫脹，細胞器減少，線粒體水腫，胞核固縮，核膜內褶，染色質分布不均；7 d組神經元、線粒體腫脹，核膜內褶明顯，核仁移向核膜；14 d組神經元內細胞器丟失，線粒體腫脹明顯，嵴間隙增寬；21～28 d組脊髓神經元線粒體腫脹，空泡變性。見圖3。

組別檢測指標S-100B陽性細胞計數 S-100B蛋白相對表達量正常組5.6±0.550.45±0.013假手術組5.4±0.540.45±0.015術后1d9.0±0.71(2)0.59±0.013(2) 7d14.2±0.84(1)(2)0.77±0.018(1)(2) 14d23.2±0.84(1)1.25±0.036(1) 21d22.2±0.83(1)1.15±0.037(1) 28d22.0±0.70(1)1.06±0.028(1)

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與術后14 d比較，P<0.05

3 討論

脊髓是中樞神經系統的重要組成部分，其活動受大腦的控制，具有重要的傳導功能，除了頭面部以外，來自軀干和四肢的淺、深部感覺以及大部分內臟感覺，都是通過脊髓白質的感覺纖維束傳達到腦，進行高級綜合分析；大腦對軀干和四肢的骨骼肌運動以及內臟(部分)的管理，通過脊髓白質的運動纖維束來完成。脊髓本身亦可完成許多反射活動，同時也是調節血管舒縮、排尿、排便和性功能活動的低級反射中樞。一旦脊髓受損，必定會給受傷者帶來沉痛的打擊?？梢?，深入了解脊髓損傷后發生的變化具有重要的意義。

注：a為正常組，b為術后1 d組，c為術后7 d組，d為術后14 d組，e為術后21 d組，f為術后28 d組;箭頭所指為線粒體

1965年Moore等[7]首先在牛腦組織中發現星形膠質源性蛋白(S-100)，因其能溶解在100%的硫酸銨飽和溶液中而得名。S-100蛋白家族大約有16個成員，其中S-100A和S-100B是其主要成員。S-100B具有高度腦特異和神經保護作用，可以提高神經元的存活率、促進膠質細胞產生神經突起、促進軸突的延伸,它在星形膠質細胞中表達最多[8-9]。S-100B有多種生理功能：(1)調節多種蛋白激酶的底物磷酸化，調節腺苷酸環化酶的活性；(2)調節細胞內外鈣離子濃度，保護神經元免受氧化損傷；(3)調節細胞的增殖、分化，參與微管、微絲的解聚；(4)被分泌到細胞外，低濃度具有神經營養和保護作用，促進軸突生長，但高濃度可引起神經元變性和誘導膠質細胞凋亡[10-11]。另外它還可以作為白細胞的化學趨化因子，調節巨噬細胞的吞噬活性。因此S-100B對于神經系統的生長發育具有重要影響，并在CNS受損時，通過急性膠質細胞反應增加S-100B合成和分泌參與神經損傷修復機制。

本實驗結果示，SCI后，傷側后肢運動、感覺功能逐漸恢復，14 d時恢復最明顯；S-100B也在SCI后開始增加，14 d時達到峰值，隨后進入平臺期。脊髓損傷機制包括即刻機械損傷和隨之發生的血管、生化反應所致的繼發性損害。有研究將脊髓損傷分為3期，(1)急性期：即傷后至最初幾天內，為脊髓及周圍組織包括血管內皮受到初始機械損傷，壞死及細胞死亡瞬間發生；受傷幾分鐘后，神經細胞會發生電解質紊亂，導致神經功能衰竭和脊髓休克，并持續約24 h。SCI早期，大量損傷及壞死的細胞被動釋放S-100B，在一定范圍內， 表達上調的S-100B可以刺激神經元生長、增強神經元在損傷后的存活；(2)繼發反應期：傷后數周內，機械損傷致細胞溶解，突觸或非突觸間的運輸，使得細胞外谷氨酸鹽及其他刺激性氨基酸濃度急劇升高，脂質過氧化和氧自由基產生，多種原因導致反應性神經膠質細胞過多以及星形膠質細胞增殖；星形膠質細胞增生、活化大量分泌S-100B，高濃度的S-100B對鄰近的易感神經元產生神經毒性作用，從而影響神經損傷的修復[12-13]；(3)慢性期：發生在受傷后數天至數年，主要機制有細胞程序性死亡范圍擴大，一些受體及離子通道濃度和活性改變，瘢痕出現，脫髓鞘導致傳導功能受損，囊性變，脊髓空洞區域擴大。Carlson等[14]總結了繼發性脊髓損傷不同機制，包括缺血、生化改變、程序性細胞死亡、毒性刺激物、神經遞質的積聚、脂質過氧化和自由基的產生及炎癥反應等，認為神經功能最終缺陷是由于繼發性損傷復合機制所致。

本實驗通過建立大鼠SCI模型，初步探討了早期及繼發反應期S-100B的表達與損傷恢復時間變化規律。隨著實驗研究不斷進展，對脊髓損傷病理生理全面認識及早期治療將會大大減少了脊髓損傷致死率、住院率及并發癥幾率，提高患者早期康復及重返社會工作的機會。

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(2015-06-07收稿，2015-07-04修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

Changes in S-100B Expression of Astrocytes after Experimental Hemi-sectioned Spinal Cord Injury of Rats

ZOU Yun, YU Zijiang, LIN Jintang

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the expression of S-100B protein of astrocytes after spinal cord injury (SCI)．Methods: Seventy healthy adult male SD rats were selected and randomly divided into 3 groups: normal control group, sham group and model of SCI group (1 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d after SCI). After the establishment of animal model of SCI, the functional recovery of the hind limb was evaluated by using BBB(Basso, Beattie and Bresnahan locomotor rating scale)and Reuter score at 1 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d. After hind limb function was scored, the rats were sacrificed to undergo S-100B immunohistochemistry staining. Western blot was adopted to detect the expression of S-100B protein in damaged area and transmission electron microscope to observe the morphological change of spinal cord after SCI in rats Results: (1)In BBB and Reuter score evaluation, the rats of SCI model groups paralyzed and showed sensory disturbance after anesthetic awareness. The neurologic function of the SCI rats' hind limb began to recover gradually, with the recovery being most obvious at 14thd. (2)HE staining showed that S-100B protein expression in each experimental groups were higher than that of normal control and sham group, with S-100B protein expression reaching the highest level at 14thd. The astrocyte in the SCI area proliferated and hypertrophied. At 28thd S-100B protein expression tended to be stable. (3)The detection of S-100B protein expression by Western blot was consistent with result of immunohistochemistry staining. (4)Under transmission electron microscope, in injured area after SCI, the neurons swelling and degeneration, the decreased number of cell organelle, mitochondrial edema and vacuolar degeneration could be observed. Conclusion: After SCI, the increased S-100B protein expression and astrocyte proliferation may be related to self-repair and regeneration of injured nerve.

spinal cord injury; restoration; nerve regeneration; astrocyte derived protein; rats, Sprague-Dawley

國家自然科學基金項目(81060108)

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2246.020.html

R322.81

A

1000-2707(2015)09-0900-05

**通信作者 E-mail:893767473@qq.com