C57-ras轉基因小鼠模型雜交1代CB6F1的生長發(fā)育特性

劉甦蘇，吳 曦，周舒雅，王辰飛，彭澤旭，左 琴，李保文，賀爭鳴，范昌發(fā)

（中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實驗動物種子中心，北京 100050）

C57-ras轉基因小鼠模型雜交1代CB6F1的生長發(fā)育特性

劉甦蘇，吳 曦，周舒雅，王辰飛，彭澤旭，左 琴，李保文，賀爭鳴，范昌發(fā)

（中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實驗動物種子中心，北京 100050）

目的測定自主建立的轉基因致癌性模型C57-ras小鼠與BALB/c小鼠雜交1代的生長發(fā)育特性參數(shù)，為該模型的商業(yè)化供應提供基礎數(shù)據(jù)。方法 將雄性轉基因陽性C57-ras小鼠與野生型雌性BALB/c小鼠交配，獲得雜交1代（CB6F1 c-Ha-ras+/-）并測定平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、陽性鼠生長發(fā)育情況、轉基因陽性率等參數(shù)。結果 在生長發(fā)育方面，雌鼠平均每窩產(chǎn)子數(shù)為8只，離乳率為90％，雄雌性別比符合預期。CB6F1的平均出生重為（1.73±0.05）g，10周齡時陽性鼠平均體重雌性（24.38±1.74）g，雄性（29.42±1.72）g。雄性鼠體重明顯高于雌性，差異存在極顯著性（P＜0.01）；基因型檢測陽性率為46.9％，符合遺傳規(guī)律。結論 轉基因致癌性模型C57-ras小鼠與BALB/c小鼠雜交1代的生長發(fā)育特性正常，可實現(xiàn)規(guī)模化商業(yè)供應。

C57-ras轉基因小鼠；人原癌基因c-Ha-ras；CB6F1；生長發(fā)育特性；

小鼠的生長發(fā)育特性是其生理學數(shù)據(jù)的組成部分也是動物飼養(yǎng)管理和健康狀況的重要指標，對建立該品系的商業(yè)化供應體系具有指導意義［1］，尤其對于新建立的轉基因品系而言，是該品系不可或缺的背景數(shù)據(jù)。

C57-ras轉基因致癌性小鼠模型是通過原核注射方法，將人原癌基因c-Ha-ras導入C57BL/6小鼠基因組中自主建立［2，3］，旨在建立新一代基因修飾動物模型以用于我國臨床前藥物致癌性實驗，促進我國建立符合 ICH規(guī)范的新評價替代方法體系［4-5］。由于C57-ras轉基因小鼠純合致死［6］，以轉基因雜合子（c-Ha-ras+/-）與C57BL/6野生型小鼠交配的方式進行傳代繁殖。通過觀察，發(fā)現(xiàn)C57-ras轉基因小鼠繁殖能力及仔鼠成活率低，而之前文獻報道其自發(fā)腫瘤的發(fā)生率較高［5，7］，故此類臨床前致癌性安全評價實驗所用動物為C57-ras陽性小鼠和BALB/cJ的雜交1代陽性鼠（CB6F1 c-Haras+/-），以降低背景腫瘤對實驗準確性的影響［7］。目前，我們已經(jīng)完成部分該模型的陽性致癌物驗證工作［10］，也開始向部分臨床前藥物評價中心提供。而該模型的平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、生產(chǎn)曲線等基本參數(shù)尚未測定，給建立商業(yè)化供應體系帶來一定難度。本文在測定c-Ha-ras轉基因陽性小鼠在CB6F1背景上生長發(fā)育性能參數(shù)的同時計算該基因檢測陽性率，旨在為其生產(chǎn)供應及應用于藥物安全評價提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

9～10周齡的雄性轉基因陽性C57-ras小鼠42只及8周齡野生型BALB/cJ雌鼠45只均飼養(yǎng)于國家嚙齒類實驗動物種子中心［SCXK（京）2009-0017］，屏障環(huán)境，溫度（18～26）℃，相對濕度50％～70％，自動光控（12 h明/12 h暗）。飼料購自北京維通利華，經(jīng)60Co輻照滅菌。飲用水為經(jīng)高壓滅菌的自來水。

本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行。實驗人員均持有北京市實驗動物從業(yè)人員上崗證。實驗設計符合“3R”原則，動物飼養(yǎng)管理及實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》法規(guī)的要求，實驗結束后實驗動物處死方法為安樂死。

1.2 儀器及試劑

TaqDNA聚合酶、DNA marker、dNTP、PCR緩沖液、蛋白酶K均購置于由寶生物工程大連有限公司（TaKaRa）。1.5 mL離心管和PCR管及蓋購自于Axygen。美國 Sartorius公司 BSA220ZS型電子天平、Thermo Nanodrop 2 000微量紫外分光光度計。引物由諾賽基因研究公司合成。

1.3 動物交配方式

雄性轉基因陽性 C57-ras小鼠與雌性野生型BALB/cJ小鼠1：1交配獲得F1代，交配采用隔天交配并記錄陰道栓的方式，每天17點合籠（標記為0 d），次日（標記為0+1 d）上午9點開始檢查雌鼠陰道栓，未成功檢栓的雌鼠與雄鼠0+1 d的17點合籠，成功檢栓的雌鼠2只一籠飼養(yǎng)待產(chǎn)，雄鼠則于0 +2 d下午17點合籠，以此類推。并于見栓14 d后挑選待產(chǎn)雌鼠，確認懷孕率。共進行3次繁殖交配實驗，每次實驗選用的繁殖親本為前一次未成功交配的雌雄鼠。

1.4 生長發(fā)育測定指標

分別記錄交配雌鼠的陰道栓見栓率以及后期懷孕率、雌鼠產(chǎn)仔數(shù)，小仔的性別比及離乳數(shù)。隨機選取4窩仔鼠，分別稱量其初生、7 d、14 d和21 d時窩重并計算單只仔鼠重量；小鼠離乳后經(jīng)PCR方法檢測 CB6F1基因型，分別稱量雌雄各 20只CB6F1（c-Ha-ras+/-）轉基因陽性鼠在4、5、6、7、8、9和10周齡時體重。

1.5 PCR反應擴增檢測雜合CB6F1小鼠基因型

檢測194只離乳小鼠，剪尾后進行蛋白酶K消化并提取基因組DNA。每只小鼠取100 ng基因組DNA，PCR檢測基因型，引物設計針對轉基因的編碼序列，上游引物為 Pri.PFT，下游引物為 Pri.PRN1735（序列見表1），目的片段408 bp。PCR條件為：95℃ 5 min變性；95℃ 30 s；62℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán)。采用內(nèi)參基因Gapdh復檢陰性樣本，確認樣本DNA提取正常，上下游引物序列及Tm值見表1。產(chǎn)物取5 μL用1.5％ 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR反應引物序列及退火溫度Tab.1 The primer sequences and annealing temperature of PCR reaction

表2 野生型BALB/cJ雌鼠見栓率、雌鼠受孕率及檢栓成功率Tab.2 The rate of vaginal plug，pregnancy rate and success rate of vaginal plug check in the wild-type BALB/cJ female mice

表3 雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，仔鼠的性別比及離乳數(shù)Tab.3 The number of newborn mice，weaned mice and sex ratio of the newborn mice

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計實驗所得數(shù)據(jù)，CB6F1（c-Haras+/-）轉基因鼠生長體重數(shù)據(jù)進行ANOVA檢驗，性別比及轉基因陽性率進行卡方檢驗，P值小于0.05作為具有顯著性差異，P值小于0.01作為極顯著性差異。統(tǒng)計結果以±s表示。

2 結果

2.1 野生型BALB/cJ雌鼠見栓率、受孕率及檢栓成功率

一共進行了3次平行的繁殖交配實驗，交配雌鼠見栓率、雌鼠受孕率及檢栓成功率見（表2）。3次實驗雌鼠見栓率及懷孕率差別比較明顯，1和2次實驗結果較為接近，見栓率及懷孕率在20％和14％左右，第3次為89.3％和60.1％。三次實驗的檢栓成功率相差不大，均值為61.6％。

2.2 BALB/cJ雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，仔鼠的性別比及離乳數(shù)

BALB/cJ雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，雜合CB6F1仔鼠的性別比及離乳數(shù)見（表3）。三批次平均窩產(chǎn)子數(shù)及離乳率的差異不明顯，平均窩產(chǎn)子數(shù)為8只，離乳率為90％。仔鼠性別比為1.2∶1與理論值1∶1進行卡方檢驗（P＞0.05），性別比符合預期。

2.3 CB6F1仔鼠的哺乳期窩重及單只仔鼠重

隨機抽取4窩哺乳期仔鼠分別測定初生0 d、7 d、14 d和21 d時的總重量并進一步計算每窩的單只仔鼠重量（表4），發(fā)現(xiàn)初生0 d、7 d、14 d時單只仔鼠重量與雌鼠哺乳期的喂養(yǎng)仔鼠個數(shù)不存在相關作用，但21 d時第2窩單只仔鼠重量明顯高于其他窩的仔鼠重量。通過計算單只仔鼠平均出生重為（1.73±0.05）g，21 d離乳時平均出生重量為（11.36±2.26）g。

表5 雜合CB6F1小鼠基因型檢測陽性率Tab.5 Transgenic positive rate in the CB6F1（c-Ha-ras+/-）mice

2.4 生長鼠的生長發(fā)育情況測定

小鼠離乳后，隨機挑選基因型檢測為陽性的轉基因CB6F1（c-Ha-ras+/-）生長鼠雌雄各10只測定其生長體重情況（圖1）。從實驗結果看，生長鼠雄性體重明顯高于雌性，差異存在極顯著性（P＜0.01）。

圖1 4周齡后CB6F1生長鼠生長發(fā)育情況Note.Abscissa is the age in weeks of mice，ordinate is the body weight of mice.Difference in the growth curves of male and female mice is analyzed using ANOVA method，＊＊P＜0.01 shows an extremely significant difference.Fig.1 The body weight of 4-week old CB6F1 mice

2.5 基因型檢測陽性率

通過檢測194只離乳小鼠，91只擴增出目的條帶且重復實驗后結果一致，判定為轉基因陽性；剩余103只陰性樣本PCR反應均擴增出內(nèi)參基因，部分實驗結果見（圖2）。該批實驗轉基因型檢測陽性率為46.9％與理論值50％進行卡方檢驗（P＞0.05），符合預期（表5）。

3 討論

近幾年來，采用為期6個月的基于轉基因動物模型的致癌性評價替代實驗在國內(nèi)部分臨床前藥物安全評價中心逐步開展起來，以逐步建立符合ICH S1B的評價體系［8］。為適應此需求，周舒雅等從正常人血液中克隆得到的6.5 kb的c-Ha-ras基因并添加啟動子和polyA后通過原核注射方法自主構建轉基因小鼠模型C57-ras［3］。繼獲得此模型后，開展了部分生物學特性分析，明確了各臟器中轉基因表達譜［9］。同時聯(lián)合國內(nèi)的藥物臨床前安全評價機構開展了致癌性評價研究［10］，有望獲得可用于藥物致癌性安全評價的快速、穩(wěn)定、有效的動物模型。

在藥物臨床前安全性評價中，為降低自發(fā)腫瘤發(fā)生率，需采用C57-ras和BALB/cJ的F1代雜交陽性動物，而該動物的出生率、離乳率等參數(shù)尚未測定。此次實驗中3次實驗的受孕率及見栓率均低于文獻報道的BALB/cJ小鼠［11］，表明在繁育時小鼠性周期的鑒定是確保小鼠按計劃時間受孕的關鍵。對比3次實驗結果，第1、2次受孕率及見栓率明顯低于第3次，可能與所用C57-ras公鼠（c-Haras+/-）有關，其均為首次交配，而第3次實驗則為二次交配，表明今后實驗時應盡量選擇交配后的雄鼠用于提高受孕率及見栓率。通過3次實驗，發(fā)現(xiàn)野生型BALB/cJ雌鼠平均產(chǎn)仔數(shù)及離乳率與文獻報道一致［12］，這表明CB6F1小鼠生長發(fā)育正常。

圖2 PCR檢測CB6F1小鼠c-Ha-ras基因及內(nèi)參基因GAPDH表達Fig.2 Identification of c-Ha-ras and internal GAPDH gene expression determined by PCR in the CB6F1 mice

通過測定CB6F1窩重，發(fā)現(xiàn)哺乳期內(nèi)單只仔鼠的體重與雌鼠代乳的仔鼠的數(shù)量關系不明顯，平均初生體重為1.73±0.05g，14 d到21 d生長速度最快，離乳時體重達到（11.36±2.26）g。分析4周齡后CB6F1陽性鼠的生長發(fā)育情況（圖1），3-5周生長較快，10周左右生長進入平臺期，且雌性小鼠較雄性小鼠生長緩慢，二者體重差異存在極顯著性（P＜0.01）。由于目前暫無該陽性小鼠的相關文獻數(shù)據(jù)，參考C57BL/6與BALB/c小鼠數(shù)據(jù)后［12］，發(fā)現(xiàn)CB6F1背景的轉基因陽性小鼠（c-Ha-ras+/-）的體重介于二者之間。進一步與相關文獻［12-14］實驗結果比較，小鼠生長發(fā)育性能正常，有利于該模型將來在臨床前安全評價中的應用。

通過離乳小鼠基因分型檢測，統(tǒng)計出該基因檢測陽性率為46.9％，符合經(jīng)典遺傳學中的孟德爾定律。

本文測定了繁殖CB6F1（c-Ha-ras+/-）小鼠的母鼠平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、陽性生長鼠生長體重，轉基因陽性率等參數(shù)，對于建立該癌癥動物模型的商業(yè)化供應體系，推動我國基于轉基因動物模型致癌性替代方法的建立有積極意義。

［1］田小蕓，惲時鋒，郭聯(lián)慶，等.Nrf2基因敲除小鼠的繁育及生長發(fā)育的生物學特性［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19（2）：50-52.

［2］范昌發(fā)，岳秉飛，王軍志，等.含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉基因小鼠的制作方法及其用途［P］.ZL 2008 1 0101666.0，2013.9.4.

［3］周舒雅，左琴，劉甦蘇，等.C57-ras轉基因小鼠模型的建立［J］.藥物分析雜志，2013，33（11）：1928-1934.

［4］范昌發(fā)，李波，王軍志，等.遺傳修飾致癌性動物模型與藥物臨床前安全性評價［D］.北方實驗動物科技年會，2009，66-68.

［5］Nielsen LL，Gurnani M，Tyler RD.Evaluation of the wap-ras transgenic mouse as a model system for testing anticancer drugs［J］.Cancer Res，1992，52：733-3738.

［6］Saitoh A，Kimura M，Takahashi R，et al.Most tumors in transgenic mice with human c-Ha-ras gene contained somatically activated transgenes［J］.Oncogene，1990，5（8）：1195 -1197.

［7］Urano1 K，Tamaoki N，Nomura T.Establishing a laboratory animal model from a transgenic animal：RasH2 mice as a model for carcinogenicity studies in regulatory science［J］.Vet Pathol，2012，49（1）：16-23.

［8］ICH Sl B.International conference on harmonization ICH S1B.（1997）［M/OL］.Guidance for industry S1B testing for carcinogenicity of pharmaceuticals.http:///www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.

［9］劉甦蘇，周舒雅，高正琴，等.c-Ha-ras在轉基因小鼠模型C57-ras各組織中的表達譜分析［J］.生物技術通訊，2013，24（5）：636-640.

［10］呂建軍，劉甦蘇，左琴，等.C57-ras轉基因小鼠模型的MNU驗證實驗［J］.藥物分析雜志，2013，33（11）：1935 -1940.

［11］張儉，黃星群，劉建軍.BALB/c小鼠繁殖性能的觀察及分析［J］.四川動物，2006，25（1）：179-181.

［12］席曉霞，秦天達，吳潤，等.SPF級BALB/c C57BL/6小鼠繁殖性能及生長發(fā)育的比較研究［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2009，28（6）：11-12.

［13］吳清洪，顧為望，張嘉寧，等.SPF級C57BLP6J小鼠生長發(fā)育和繁殖性能指標的測定［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16（10）：606-607.

［14］張洪，鮑波.淺談國內(nèi)BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學特性［J］.中國實用醫(yī)藥，2010，5（3）：252-254.

Characterization of growth performance of F1 hybrid CB6F1 C57-ras transgenic mouse model

LIU Su-su，WU Xi，ZHOU Shu-ya，WANG Chen-fei，PENG Ze-xu，ZUO Qin，
LI Bao-wen，HE Zheng-ming，F(xiàn)AN Chang-fa（National Rodent Laboratory Animal Center，National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective To obtain the basic growth parameters of a self-established F1 hybrid CB6F1 C57-ras transgenic mouse model，and to provide basic information for commercialization of this mouse model.Methods F1 hybrid mice（CB6F1）were produced by crossing C57-ras heterozygous transgenic（c-Ha-ras+/-）male mice and wild-type BALB/cJ female mice.The average litter size，weaning rate，sex ratio，growth performance and C57-ras transgenic positive rate were recorded and analyzed.Results The average litter size was eight，weaning rate was 90％，and sex ratio was approximately in accordance with prediction.The average body weight of newborn mice was 1.73±0.05 g.The average body weight of 10-week old c-Ha-ras transgenic female and male mice in CB6F1 background was 24.38±1.74 g and 29.42 ±1.72g，respectively，which had a significant difference（P＜0.01）.The c-Ha-ras transgenic positive rate was 46.9％.which was in accordance with genetic rules.Conclusions The F1 hybrid mice（CB6F1）produced by crossing C57-ras heterozygous transgenic（c-Ha-ras+/-）male mice and wild-type BALB/cJ female mice show normal growth performance and development characteristics，and it can be used for large-scale commercial supply.

C57-ras transgenic mice，Human c-Ha-ras gene，CB6F1，Growth performance

R33

A

1671-7856（2015）04-0018-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.004

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（批準號：2010C4）資助的課題。

劉甦蘇（1981-），女，助理研究員，主要從事模式動物相關工作。

范昌發(fā)（1970-），男，博士，研究員，主要從事模式動物研究。Email：fancf@nifdc.org.cn。

2015-01-21