大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備及其穩(wěn)定性研究

李亞璞（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊050081）

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大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備及其穩(wěn)定性研究

李亞璞
（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊050081）

摘要：為了實現(xiàn)對脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速篩選，通過雙抗體夾心法利用大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的單抗及脂肪氧化酶多抗制備了大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。結(jié)果表明，該試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩(wěn)定性良好，并可實現(xiàn)對脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速檢測。

關(guān)鍵詞：大豆；脂肪氧化酶-Ⅲ；單克隆抗體；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫試劑盒

脂肪氧化酶（lipoxygenase，簡寫Lox）能專一催化多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的脂肪氫過氧化物，再經(jīng)裂解酶分解生成短碳鏈的醇、酮和醛類等揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致大豆及其制品產(chǎn)生豆腥味，限制了大豆及其制品的廣泛應(yīng)用。該酶于1932年首次在大豆中被發(fā)現(xiàn)，分別命名為脂肪氧化酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[1]。目前，常規(guī)消除豆腥味的方法有物理法和化學(xué)法，但解決這一問題的根本途徑還是育種法。因此，選育脂肪氧化酶缺失的大豆品種是當(dāng)前研究的熱點。

1971年，Engvall和Perlmann報道了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在免疫球蛋白（IgG）定量分析中的應(yīng)用，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成測定樣本中微量物質(zhì)的一種定量方法，其基本原理是抗原（抗體）的固相化及抗原（抗體）的酶標(biāo)記。ELISA雙抗體夾心法的原理是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣本中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，利用顯色的深淺可以判斷抗原含量或有無。近年來，隨著免疫方法學(xué)的迅速發(fā)展，因其具有特異性強、敏感性高、檢測方便快速等優(yōu)點，酶聯(lián)免疫測定技術(shù)正愈來愈廣泛地應(yīng)用于對樣品材料中痕量物質(zhì)的檢測。利用抗原與抗體的特異專一性親和反應(yīng)鑒定大豆脂肪氧化酶同工酶，可成功地進行群體規(guī)模Lox類型的篩選。利用這一技術(shù)，筆者研制出一種測定大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的免疫快速檢測試劑盒，用于篩選大豆脂肪氧化酶同工酶缺失的新材料，對大豆育種具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用大豆來自于河北省農(nóng)科院糧油作物研究所；分泌大豆脂肪氧化酶-Ⅲ特異性抗體的細(xì)胞株由河北省科學(xué)院生物研究所細(xì)胞生化室保藏。供試動物為BALB/c小鼠、新西蘭大白兔，均購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

試驗主要試劑有Lipoxidase preparation、TypeI-B （Sigma L7395-15MU）、Tween-20、Glycerol（Solarbio Reagent Grade），酶穩(wěn)定劑、酶聯(lián)稀釋液（泰天和公司），辣根過氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸鹽、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、海藻糖、完全佐劑、不完全佐劑（Sigma公司），檸檬酸、過碘酸鈉、乙二醇、硼氫化鈉（國產(chǎn)分析純），超純水（自制）。

主要試驗儀器有倒置顯微鏡（Olympus），移液槍、洗板機（Thermo），酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司），超速低溫離心機（HITACHI），酶標(biāo)板（Costar），其他儀器均為國產(chǎn)普通儀器。

1.2試驗方法

1.2.1抗脂肪氧化酶多克隆抗體的制備及純化稱量Lipoxidase粉末，用超純水稀釋成1 mg/mL，按一定劑量分裝后對新西蘭大白兔進行免疫反應(yīng)，制備抗脂肪氧化酶多克隆抗體。取一定量的抗脂肪氧化酶多克隆抗體，在血清中加入硫酸銨，加入量為0.313 g/mL，攪拌30 min，取沉淀溶于0.01 mol/L的PBS中，透析過夜，取出并測定效價。

1.2.2抗脂肪氧化酶單克隆抗體的制備及純化復(fù)蘇抗脂肪氧化酶-Ⅲ細(xì)胞株，細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，注入小鼠腹腔誘生腹水，制備抗脂肪氧化酶-Ⅲ的單克隆抗體。腹水采用辛酸-硫酸銨法純化，用SDS-PAGE法對抗體純度進行鑒定，并對純化抗體進行效價測定、親和力測定和交叉反應(yīng)測定。

1.2.3單克隆抗體的酶標(biāo)及酶標(biāo)抗體工作濃度的測定以辣根過氧化物酶（HRP）采用改良過碘酸鈉法標(biāo)記抗體[2-3]，并通過間接ELISA法對標(biāo)酶抗體進行最適工作濃度測定。

1.2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA試劑盒的穩(wěn)定性測試（1）多克隆抗體在酶標(biāo)板上的固定技術(shù)和保存期測定。分別以10、5、2.5、1.25 g/mL的抗體包被酶標(biāo)板，篩選最佳的抗體包被濃度。將處理好的酶標(biāo)板條置于鋁箔袋中抽真空，然后加干燥劑密閉包裝，分別置于4℃、37℃條件下做保存期測試。（2）酶標(biāo)抗體稀釋液的保存期測定，研究保護液對低濃度酶結(jié)合物長期保存穩(wěn)定性的影響。（3）試劑盒中其他液體的保存期測定。試劑盒中其他液體包括洗液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液和顯色液，這些試劑的保存期測定在4℃下進行，定期取出觀察是否有染菌現(xiàn)象，連續(xù)觀察6個月并對其進行ELISA試驗測定光吸收值。（4）試劑盒保存期測定。試劑盒在2～8℃下的穩(wěn)定性試驗方案如下：取出新制備的試劑盒于4℃冰箱中保存，分別于第0、1、2、3、4、5和6個月將試劑盒取出對大豆特殊材料進行檢測，以驗證試劑盒的準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果與分析

2.1多克隆抗體純化后效價

新西蘭大白兔經(jīng)過4次免疫后取血，離心后取上清即為抗脂氧酶多克隆抗體，該抗體經(jīng)飽和硫酸銨法純化后測定效價為1︰1638400，蛋白濃度為32mg/mL。

2.2單克隆抗體純化后效價

單抗經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后，用凝膠成像分析純度為86%，蛋白含量為16.8 mg/mL；抗體效價為1︰1 638 400，與只含有Lox-Ⅰ、Lox-Ⅱ的試驗材料反應(yīng)，效價僅為1︰51 200，交叉較小；抗體親和力指數(shù)在109以上。

2.3標(biāo)酶抗體的最適工作濃度

采用間接ELISA法測定最佳的酶標(biāo)抗體工作濃度，以Lox-Ⅲ的抗原包板，確定該酶標(biāo)抗體最高的稀釋倍數(shù)為1︰800 000，以3%的BSA和10%的BSA包板，確定該酶標(biāo)抗體最低的稀釋倍數(shù)為1︰3 200，酶標(biāo)抗體最佳的工作濃度為1︰400 000；方陣滴定法測定酶標(biāo)抗體在ELISA試劑盒中實際的工作濃度為1︰5 000，這樣既可以節(jié)省酶標(biāo)抗體，又可以使該酶標(biāo)抗體在酶標(biāo)稀釋液中較長時間保存。

2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA試劑盒的穩(wěn)定性

2.4.1試劑盒的組成該試劑盒主要由96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體稀釋液、濃縮洗液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液，顯色液和終止液等8種液體組成。

2.4.2酶標(biāo)板保護劑篩選及保存期經(jīng)過方陣試驗，最佳的抗體包被濃度為5 g/mL；酶標(biāo)板經(jīng)過穩(wěn)定劑處理，37℃加速破壞3 d，與4℃放置的板子相比，讀值下降了8.51%，符合試劑盒規(guī)定要求，酶標(biāo)板可以在4℃條件下保存6個月。

2.4.3酶標(biāo)抗體稀釋液配方的篩選及保存期將酶標(biāo)抗體稀釋液在4℃下保存6個月，其活性降低了18%；而在37℃加速試驗的第4天，其活性降低了16.7%，二者下降率均在20%以內(nèi)，這說明該酶標(biāo)抗體稀釋液可以將酶標(biāo)抗體穩(wěn)定保存6個月。

2.4.4試劑盒中其他液體的保存期試劑盒的穩(wěn)定性除了與關(guān)鍵試劑密切相關(guān)外，試劑盒中的其他試劑對試劑盒的穩(wěn)定性也有一定的影響[4-5]。試驗測定結(jié)果顯示，在4℃下保存6個月，試劑盒中的洗液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液和顯色液無染菌現(xiàn)象，而且其光吸收值變化不大。這說明試劑盒中其他液體對試劑盒的影響不大，只要各種液體在配置過程中按規(guī)定無菌操作，以上幾種液體可以較長時間保存。

表1　試劑盒的準(zhǔn)確性測定

2.4.5試劑盒準(zhǔn)確性由表1可知，在4℃下保存6個月，試劑盒的光吸收值變化不大。這說明該試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩(wěn)定性良好。

3　結(jié)論

試驗通過對試劑盒中關(guān)鍵試劑以及試劑盒整體的加速試驗，該Lox-Ⅲ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩(wěn)定性良好，能夠定性檢測出含有脂氧酶-Ⅲ的大豆材料。研究結(jié)果顯示，該試劑盒中試劑穩(wěn)定性良好，不僅可以長時間保存，而且對儲存及運輸條件的要求也較低，可極大地提高試劑盒的使用范圍。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：成平）

Preparation of ELISA Kit for Soybean Lipoxygenase-Ⅲand Its Stability

LI Ya-pu
（Institute of Biology, Hebei Academy of Science, Shijiazhuang 050081, PRC）

Abstract：In order to realize the rapid screening of soybean material which lacking lipoxygenase-Ⅲ, an ELISA kit was made by double antibody sandwich method which utilizing the polyclonal antibodies and monoclonal antibodies specific for soybean lipoxygenase-Ⅲ. The results showed that the effective time of the ELISA kit was six months, which stored at 2～8℃, and its stability and accuracy were good, it can be used for quick detecting for soybean material which lack lipoxygenase-Ⅲ.

Key words：soybean; lipoxygenase-Ⅲ; monoclonal antibody; polyclonal antibody; ELISA kit

作者簡介：李亞璞（1980-），女，河北鹿泉市人，助理研究員，主要從事免疫檢測技術(shù)研究。

收稿日期：2015-04-23

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.07.030

中圖分類號：R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）07-0102-03