大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶聯免疫檢測試劑盒的制備及其穩定性研究

李亞璞（河北省科學院生物研究所，河北石家莊050081）

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大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶聯免疫檢測試劑盒的制備及其穩定性研究

李亞璞
（河北省科學院生物研究所，河北石家莊050081）

摘要：為了實現對脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速篩選，通過雙抗體夾心法利用大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的單抗及脂肪氧化酶多抗制備了大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的酶聯免疫檢測試劑盒。結果表明，該試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩定性良好，并可實現對脂肪氧化酶-Ⅲ缺失大豆材料的快速檢測。

關鍵詞：大豆；脂肪氧化酶-Ⅲ；單克隆抗體；多克隆抗體；酶聯免疫試劑盒

脂肪氧化酶（lipoxygenase，簡寫Lox）能專一催化多元不飽和脂肪酸加氧反應，生成具有共軛雙鍵的脂肪氫過氧化物，再經裂解酶分解生成短碳鏈的醇、酮和醛類等揮發性物質，導致大豆及其制品產生豆腥味，限制了大豆及其制品的廣泛應用。該酶于1932年首次在大豆中被發現，分別命名為脂肪氧化酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[1]。目前，常規消除豆腥味的方法有物理法和化學法，但解決這一問題的根本途徑還是育種法。因此，選育脂肪氧化酶缺失的大豆品種是當前研究的熱點。

1971年，Engvall和Perlmann報道了酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在免疫球蛋白（IgG）定量分析中的應用，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成測定樣本中微量物質的一種定量方法，其基本原理是抗原（抗體）的固相化及抗原（抗體）的酶標記。ELISA雙抗體夾心法的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣本中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，利用顯色的深淺可以判斷抗原含量或有無。近年來，隨著免疫方法學的迅速發展，因其具有特異性強、敏感性高、檢測方便快速等優點，酶聯免疫測定技術正愈來愈廣泛地應用于對樣品材料中痕量物質的檢測。利用抗原與抗體的特異專一性親和反應鑒定大豆脂肪氧化酶同工酶，可成功地進行群體規模Lox類型的篩選。利用這一技術，筆者研制出一種測定大豆脂肪氧化酶-Ⅲ的免疫快速檢測試劑盒，用于篩選大豆脂肪氧化酶同工酶缺失的新材料，對大豆育種具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用大豆來自于河北省農科院糧油作物研究所；分泌大豆脂肪氧化酶-Ⅲ特異性抗體的細胞株由河北省科學院生物研究所細胞生化室保藏。供試動物為BALB/c小鼠、新西蘭大白兔，均購自河北醫科大學實驗動物中心。

試驗主要試劑有Lipoxidase preparation、TypeI-B （Sigma L7395-15MU）、Tween-20、Glycerol（Solarbio Reagent Grade），酶穩定劑、酶聯稀釋液（泰天和公司），辣根過氧化物酶、四甲基聯苯胺二鹽酸鹽、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、海藻糖、完全佐劑、不完全佐劑（Sigma公司），檸檬酸、過碘酸鈉、乙二醇、硼氫化鈉（國產分析純），超純水（自制）。

主要試驗儀器有倒置顯微鏡（Olympus），移液槍、洗板機（Thermo），酶標儀（美國Bio-TEK），二氧化碳恒溫培養箱（SANYO公司），超速低溫離心機（HITACHI），酶標板（Costar），其他儀器均為國產普通儀器。

1.2試驗方法

1.2.1抗脂肪氧化酶多克隆抗體的制備及純化稱量Lipoxidase粉末，用超純水稀釋成1 mg/mL，按一定劑量分裝后對新西蘭大白兔進行免疫反應，制備抗脂肪氧化酶多克隆抗體。取一定量的抗脂肪氧化酶多克隆抗體，在血清中加入硫酸銨，加入量為0.313 g/mL，攪拌30 min，取沉淀溶于0.01 mol/L的PBS中，透析過夜，取出并測定效價。

1.2.2抗脂肪氧化酶單克隆抗體的制備及純化復蘇抗脂肪氧化酶-Ⅲ細胞株，細胞經過培養后，注入小鼠腹腔誘生腹水，制備抗脂肪氧化酶-Ⅲ的單克隆抗體。腹水采用辛酸-硫酸銨法純化，用SDS-PAGE法對抗體純度進行鑒定，并對純化抗體進行效價測定、親和力測定和交叉反應測定。

1.2.3單克隆抗體的酶標及酶標抗體工作濃度的測定以辣根過氧化物酶（HRP）采用改良過碘酸鈉法標記抗體[2-3]，并通過間接ELISA法對標酶抗體進行最適工作濃度測定。

1.2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA試劑盒的穩定性測試（1）多克隆抗體在酶標板上的固定技術和保存期測定。分別以10、5、2.5、1.25 g/mL的抗體包被酶標板，篩選最佳的抗體包被濃度。將處理好的酶標板條置于鋁箔袋中抽真空，然后加干燥劑密閉包裝，分別置于4℃、37℃條件下做保存期測試。（2）酶標抗體稀釋液的保存期測定，研究保護液對低濃度酶結合物長期保存穩定性的影響。（3）試劑盒中其他液體的保存期測定。試劑盒中其他液體包括洗液、標準品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液和顯色液，這些試劑的保存期測定在4℃下進行，定期取出觀察是否有染菌現象，連續觀察6個月并對其進行ELISA試驗測定光吸收值。（4）試劑盒保存期測定。試劑盒在2～8℃下的穩定性試驗方案如下：取出新制備的試劑盒于4℃冰箱中保存，分別于第0、1、2、3、4、5和6個月將試劑盒取出對大豆特殊材料進行檢測，以驗證試劑盒的準確性。

2　結果與分析

2.1多克隆抗體純化后效價

新西蘭大白兔經過4次免疫后取血，離心后取上清即為抗脂氧酶多克隆抗體，該抗體經飽和硫酸銨法純化后測定效價為1︰1638400，蛋白濃度為32mg/mL。

2.2單克隆抗體純化后效價

單抗經辛酸-硫酸銨法純化后，用凝膠成像分析純度為86%，蛋白含量為16.8 mg/mL；抗體效價為1︰1 638 400，與只含有Lox-Ⅰ、Lox-Ⅱ的試驗材料反應，效價僅為1︰51 200，交叉較小；抗體親和力指數在109以上。

2.3標酶抗體的最適工作濃度

采用間接ELISA法測定最佳的酶標抗體工作濃度，以Lox-Ⅲ的抗原包板，確定該酶標抗體最高的稀釋倍數為1︰800 000，以3%的BSA和10%的BSA包板，確定該酶標抗體最低的稀釋倍數為1︰3 200，酶標抗體最佳的工作濃度為1︰400 000；方陣滴定法測定酶標抗體在ELISA試劑盒中實際的工作濃度為1︰5 000，這樣既可以節省酶標抗體，又可以使該酶標抗體在酶標稀釋液中較長時間保存。

2.4大豆脂肪氧化酶-ⅢELISA試劑盒的穩定性

2.4.1試劑盒的組成該試劑盒主要由96孔酶標板、酶標抗體稀釋液、濃縮洗液、標準品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液，顯色液和終止液等8種液體組成。

2.4.2酶標板保護劑篩選及保存期經過方陣試驗，最佳的抗體包被濃度為5 g/mL；酶標板經過穩定劑處理，37℃加速破壞3 d，與4℃放置的板子相比，讀值下降了8.51%，符合試劑盒規定要求，酶標板可以在4℃條件下保存6個月。

2.4.3酶標抗體稀釋液配方的篩選及保存期將酶標抗體稀釋液在4℃下保存6個月，其活性降低了18%；而在37℃加速試驗的第4天，其活性降低了16.7%，二者下降率均在20%以內，這說明該酶標抗體稀釋液可以將酶標抗體穩定保存6個月。

2.4.4試劑盒中其他液體的保存期試劑盒的穩定性除了與關鍵試劑密切相關外，試劑盒中的其他試劑對試劑盒的穩定性也有一定的影響[4-5]。試驗測定結果顯示，在4℃下保存6個月，試劑盒中的洗液、標準品溶液、樣品處理液、樣品稀釋液和顯色液無染菌現象，而且其光吸收值變化不大。這說明試劑盒中其他液體對試劑盒的影響不大，只要各種液體在配置過程中按規定無菌操作，以上幾種液體可以較長時間保存。

表1　試劑盒的準確性測定

2.4.5試劑盒準確性由表1可知，在4℃下保存6個月，試劑盒的光吸收值變化不大。這說明該試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩定性良好。

3　結論

試驗通過對試劑盒中關鍵試劑以及試劑盒整體的加速試驗，該Lox-Ⅲ酶聯免疫檢測試劑盒在2～8℃條件下可以保存6個月，穩定性良好，能夠定性檢測出含有脂氧酶-Ⅲ的大豆材料。研究結果顯示，該試劑盒中試劑穩定性良好，不僅可以長時間保存，而且對儲存及運輸條件的要求也較低，可極大地提高試劑盒的使用范圍。

參考文獻：

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[3]張趁華，蔡家利.兔抗小鼠IgG-HRP酶標抗體的制備及應用[J].莆田學院學報，2011，18（2）：19-23.

[4]宋惠娟，向凌云，史楠，等.丙型肝炎病毒抗體酶聯免疫診斷試劑中酶結合物稀釋液對酶結合物穩定性影響的研究[J].藥品評價，2005，2（5）：351-353.

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（責任編輯：成平）

Preparation of ELISA Kit for Soybean Lipoxygenase-Ⅲand Its Stability

LI Ya-pu
（Institute of Biology, Hebei Academy of Science, Shijiazhuang 050081, PRC）

Abstract：In order to realize the rapid screening of soybean material which lacking lipoxygenase-Ⅲ, an ELISA kit was made by double antibody sandwich method which utilizing the polyclonal antibodies and monoclonal antibodies specific for soybean lipoxygenase-Ⅲ. The results showed that the effective time of the ELISA kit was six months, which stored at 2～8℃, and its stability and accuracy were good, it can be used for quick detecting for soybean material which lack lipoxygenase-Ⅲ.

Key words：soybean; lipoxygenase-Ⅲ; monoclonal antibody; polyclonal antibody; ELISA kit

作者簡介：李亞璞（1980-），女，河北鹿泉市人，助理研究員，主要從事免疫檢測技術研究。

收稿日期：2015-04-23

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.07.030

中圖分類號：R446.61

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）07-0102-03