丙酮—丁醇的微生物發酵生產

朱會芹　王瑞飛

摘 要：在過去的一段歷史時期內，丙酮-丁醇發酵一度因生產成本高，產率低而發展遲緩。近年來，隨著能源需求的改變及環境保護的要求，其可再生、無污染的優點再次引起人們的關注。該文對丙酮-丁醇發酵過程中所需的可替代性原料、高產菌株選育技術及相關發酵工藝等方面的最新進展進行了總結，并對這些方面進行了簡單評述。

關鍵詞：生物燃料 微生物發酵 可替代性原料 菌株選育 發酵工藝

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）12（a）-0120-03

丙酮-丁醇發酵歷史悠久，早在1912年，人們開始利用梭狀芽孢桿菌發酵，即以糧食作物為原料生產丙酮和丁醇[1]。該產業一度成為世界上第二大發酵產業，用于生產火藥、合成橡膠等重要的化學品。直到20世紀中葉，廉價的石油被大量開采和利用，以石油為原料來合成化工產品的方法快速興起，導致丙酮-丁醇發酵方法的利用越來越少，其發酵工藝的改進也嚴重遲滯。進入21世紀后，由于人類長時間的開采，石化資源已接近耗竭；另外，由于工藝水平和處理技術的限制，大量含有石油類的廢渣、廢水排放引起了嚴重的環境污染。為了貫徹經濟與生態環境協調發展的方針政策，尋找綠色能源已經成為迫在眉睫之事。此時，丙酮-丁醇發酵途徑再次引起人們的極大關注，微生物發酵制丙酮-丁醇較原來丙酮-丁醇發酵的優點是發酵周期短、產物轉化率高、代謝副產物少。因此即使目前微生物發酵產丙酮-丁醇成本高，尚不具有很大的競爭市場，但是通過原料和技術的改進后可以降低生產成本、增加產量，丁醇將成為最具實用價值的廉價、清潔的新型液態生物燃料。該文章對近年來改善丙酮-丁醇發酵的相關方法和措施進行綜述，以期對相關領域的研究人員有所幫助。

1 生產丙酮-丁醇的可替代性原料

目前，工業生產丙酮和丁醇主要以農作物為原料，存在著成本高，產量相對較低的問題。為了解決這種問題，需要尋找可替代原料。近年來發現的可替代原料主要有木質纖維素類、合成氣、廢棄蛋白質類。目前認為，木質纖維素類生物質是世界上最豐富、最廉價的可再生能源，木質纖維素類包括森林殘留物和農業殘留物，都可用acetone-butanol-ethanol（ABE）梭狀芽孢桿菌發酵生產丙酮和丁醇，但是對于不同的木質纖維素類原料，丙酮-丁醇的生產效率也不盡相同。Swana等[2]用4種原料：柳枝稷、楊樹、玉米秸稈、小麥秸稈生產丁醇時發現，玉米秸稈是生產丁醇產量最高的原料，其在生產丙酮和丁醇過程中最大利用率可達75%。依據當前情況看，玉米秸稈仍是纖維素類物質中用于生產丙酮和丁醇的首要選擇。合成氣是由CO、H2、CO2等組成的混合氣體，合成氣發酵燃料是一種商業化的邊緣技術，其低成本的發酵媒介提高了發酵過程的可行性。例如，使用玉米漿（CSL）代替酵母提取物，發酵介質成本減少了27%，乙醇的產量較原來多出78%。CSL介質用于連續發酵時，產生乙醇、正丙醇、正丁醇的最大濃度分別是8 g·L-1、6 g·L-1、1 g·L-1[3]。隨著人們生活水平的提升，動物垃圾和糞便越來越多，其中富含豐富的蛋白質，回收利用廢棄蛋白質用于生物燃料生產不僅有利于改善環境也擴大了能源來源。但是，微生物很少利用廢棄蛋白來制得生物燃料，這就需要對現有菌株進行改造。Choia等利用抑制B. subtilis的支鏈氨基酸代謝途徑以及敲除脂肪酰轉移酶的手段，發酵生產更多的丁醇、異丁醇等生物燃料。利用木質纖維素類、合成氣、廢棄蛋白質類可替代性廢棄原料生產丙酮-丁醇，仍然是相對不成熟的技術，需要繼續研究探討其商業化的可行性。

2 丙酮-丁醇高產菌株選育

丙酮-丁醇高產菌株選育是通過改良菌種以及改進現有的發酵工藝來提高其產量的過程。改良菌種可以利用誘變育種、代謝工程改造和基因重組技術來實現，其中，誘變育種技術需要外界環境對菌種產生干擾，如等離子體干擾等，進而改變微生物的遺傳性狀增加丙酮-丁醇轉化率，這種育種方法操作簡便、速度快、收效大，也是目前菌種選育的主要方法。例如，Li等在大氣和室溫等離子體環境下培養acetobutylicum梭狀芽胞桿菌PW12，獲得其突變菌株ART18，生產丁醇為（11.3±0.5） g·L-1，比原來野生型菌株高出31%。代謝工程改造通過基因表達、敲除基因等手段改進細胞代謝特性。例如，Hou等使C.acetobutylicum菌株的adc基因失活消除丙酮生產，同時把與谷胱甘肽生物合成能力有關的大腸桿菌的adc gshAB基因導入c acetobutylicum菌株，以增強其健壯性。在此過程中，丁醇生產從（5.17±0.26） g·L-1提高到（8.27±0.27） g·L-1。基因敲除是改變某些基因序列，導致相關基因功能喪失，進一步對生物體遺傳性狀造成影響的技術。該技術在丙酮-丁醇高產菌株選育中也有應用，Xu等發現梭狀芽胞桿菌突變珠acetobutylicum JB200的單一堿基缺失導致Cterminal cac3319基因不能編碼組氨酸激酶，致使丁醇產量（18.2±1.3和12.6±0.2 g·L-1）比野生型的菌株高出44.4%。基因重組是指在生物體產生后代的過程中，控制不同性狀的基因重新組合，Gao等利用Clostridium acetobutylicumCICC 8012菌株，通過基因重組獲得高產菌株 F2-GA，其發酵72 h后丁醇/丙酮/乙醇總溶劑的產量達到了22.21 g·L-1，與原始菌株比，丁醇產量提高了34.53%。丙酮-丁醇高產菌株選育改變了原有菌株的結構，使菌株的遺傳性狀發生改變，大大提高了丙酮-丁醇的產量。在以后的研究中，人們所面臨的巨大挑戰是，如何進一步將這些菌株進行改造，使其能夠在工業生產中大規模使用。

3 改進丙酮-丁醇發酵工藝

為了更好地發展丙酮-丁醇工藝，可以對發酵條件進行優化，或者增加對發酵過程中輔因子的調節。

3.1 發酵條件優化

對于不同的菌株所需培養的外界條件不同，為了使菌株產量達到最大化，必須尋找最佳培養條件，使高產基因有效表達。培養條件的影響因素包括多種，如最適pH和比較完善的培養系統等，都能影響丙酮-丁醇產量，Jiang等發現pH是梭狀芽胞桿菌生產丙酮、丁醇、乙醇過程中的一個重要影響因素。在這項研究中，梭狀芽胞桿菌beijerinckii IB4在不同pH值從4.9到6.0下進行分批發酵，在pH值為5.5時，ABE產量逐漸占優勢，其最大濃度達到24.6 g·L-1 （15.7 g·Lof-1丁醇、8.63 g·L-1的丙酮和0.32 g·L-1的乙醇），此過程歷經36 h消費60 g·L-1葡萄糖。與pH不受控制的情況相比，丙酮-丁醇產量大大提高。除了培養條件之外，培養系統也能影響丁醇生產效率。Wang等開發出一種培養系統，該系統利用不同微生物的特定代謝能力直接產生丁醇。該研究主要目的在于尋找互補的微生物進行丁醇生產，結果發現，新的微生物團體N3和菌株c celevecrescens N3-2能有效降解纖維素和產生大量的丁醇。由此可知，通過改變發酵過程的培養條件，營造適宜的轉化環境，可以從很大程度上推動丁醇的發酵效率增加。

3.2 梭菌輔因子擾動

丙酮-丁醇發酵過程中存在許多輔因子，它們有的能夠促進丁醇生產，有的卻對丁醇產生很大干擾，這些輔因子（包括ATP/ADP，NADH/NAD+等）在微生物代謝系統中廣泛存在。它們在發酵過程中幾乎為全部生化反應提供能量、還原力，所以具有掌控全局的效應。正因為如此，丙酮-丁醇梭菌輔因子的研究意義十分重大。ATP主要參與底物水平磷酸化和氧化磷酸化，是在線粒體中完成ATP合成，可以通過調節電子傳遞鏈以及氧氣供給量來影響ATP，進而影響丁醇產量。因此，利用一系列酶的作用，對電子傳遞鏈的活性進行調控，可以影響ATP合成。Kuit等改變C.acetobutylicum菌株基因結構，減少醋酸酶激酶，抑制磷酸乙酰乙酸去磷酸化促使ADP生成ATP，致使C. acetobutylicum菌株增加乙醇（63%）、丁醇（16%）產量并減少乳酸（50%）的產生。另外，NADH/NAD+氧化還原力調控在調節微生物代謝方面起著至關重要的作用，它一般分為外源生化過程和內源基因工程手段對氧化還原力進行調控。例如，Yang等利用外源調節發酵過程中的還原力，通過人工控制溶解氧和酶物質，效價提高到102.3 g·L-1，收益率是0.44 g·g-1，以及丁醇生產力達到1.16 g·L-1·h-1。Li等通過內源調節把煙酸（NADH和NADPH的前體）加入野生型梭狀芽孢桿菌的生長介質中，細胞生長速率和丁醇生成速率大大增加。控制胞內能量和還原力供應能有效地改變微生物發酵過程中的代謝途徑，也可以促進微生物最大化地合成目標產物，增加代謝速率，提高微生物發酵的經濟性和競爭力。

4 結語

生物丁醇較乙醇是一種更好的可再生燃料，很可能代替汽油再次成為一種重要的化工原料。當前迫切需要解決的問題是提高生物發酵丁醇產量及進一步降低其生產成本。根據目前已有報道，可以從以下方面增加丁醇產量：丁醇在商業化的進程中對原料選擇很苛刻，農作物作為丁醇原料已不能滿足當前的市場需求，因此，農業廢棄物（木質纖維原料）和便宜的工業廢棄物在未來將會被大規模利用；目前應用的梭狀芽孢桿菌生產的丁醇產量較低，急需選育高產菌株和提高菌株利用率；丙酮-丁醇發酵工藝可以大大加速發酵進程，通過優化發酵條件，實施梭菌輔因子擾動，可以降低成本，增加丁醇產量。目前，我國對生物丁醇的研究也逐漸增加，國家許多項目如“973”“863”計劃等都涉及了丁醇生產。隨著國家的投入力度增大，丁醇技術也越來越成熟，我國丁醇發展前景將十分廣闊。

參考文獻

[1] Green EM. Fermentative production of butanol—the industrial perspective[J]. Current Opinion in Biotechnology，2011，22（3）：337-343.

[2] Swana J，Yang Y， Behnam M，etal.An analysis of net energy production and feedstock availability for biobutanol and bioethanol[J]. Bioresource Technology ，2011，102（2）：2112-2117.

[3] Liu K， Atiyeh H K， Stevenson B S，etal.Continuous syngas fermentation for the production of ethanol，n-propanol and n-butanol[J]. Bioresource Technology，2014（151）：69-77.