CXCR4啟動子的條件復制型腺病毒對肺癌細胞的靶向殺傷作用*

李龍光，李書華，王紅艷，龍　捷，謝曉斌，張雅潔(廣州醫科大學病理學教研室，廣東廣州510182)

CXCR4啟動子的條件復制型腺病毒對肺癌細胞的靶向殺傷作用*

李龍光，李書華，王紅艷，龍捷，謝曉斌，張雅潔△
(廣州醫科大學病理學教研室，廣東廣州510182)

［摘要］目的:構建CXCR4啟動子的條件復制型腺病毒載體CRAd-CXCR4-GFP，探究CRAd-CXCR4-GFP對肺癌細胞的靶向殺傷效應。方法: PCR法擴增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭質粒pDC316-GFP，將骨架質粒pBHG-lox-E1，3Cre和重組質粒pDC316-CXCR4-GFP共轉染293細胞，產生重組腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并擴增，擴增后進行PCR鑒定和腺病毒滴度測定; real-time PCR檢測5種肺癌細胞株CXCR4的mRNA表達，篩選出表達最高的A549細胞;將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉染A549細胞，檢測兩者轉染后CXCR4啟動子活性和腺病毒復制數;將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉染A549細胞和16HBE細胞，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，CCK-8檢測各組細胞活性。結果:成功構建重組質粒pDC316-CXCR4-GFP，與骨架質粒pBHG-lox-E1，3Cre共轉染293細胞后第11天可見片狀綠色熒光; PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重組腺病毒基因組中;測定重組腺病毒滴度為1×10(13)PFU/L; CRAd-CXCR4-GFP轉染A549細胞后E1A的mRNA和E4表達較Ad-NULL組明顯上升;與Ad-NULL組和空白對照組相比，CRAd-CXCR4-GFP組前4 d A549細胞凋亡率和活性無明顯差異，第5天細胞凋亡率明顯增加，細胞活性明顯降低，各組間5 d內16HBE細胞的細胞凋亡率和細胞活性均無明顯變化。結論:成功構建條件復制型腺病毒表達載體CRAd-CXCR4-GFP，該載體對肺癌細胞具有靶向殺傷作用。

［關鍵詞］條件復制型腺病毒;腫瘤特異性啟動子; CXCR4啟動子

條件復制型腺病毒是一組經過基因改造的腺病毒，它能夠選擇性地在腫瘤細胞中完成感染和復制周期，從而特異性溶解腫瘤細胞，卻不傷及正常細胞。利用腫瘤特異性啟動子調控腺病毒復制必需基因E1A是構建條件復制型腺病毒的常用方法，而條件復制型腺病毒在臨床應用中仍出現啟動子廣譜性差的問題［1］。

CXCR4是趨化因子SDF-1的特異性受體，目前已經發現CXCR4在多種組織中表達而在正常組織幾乎不表達，與常用的腫瘤特異性啟動子survivin、hTERT和COX-2相比，CXCR4啟動子在肝臟的活性很低［2］。因此，為進一步增強治療基因的靶向性，我們利用CXCR4啟動子能特異性使腺病毒在肺癌細胞內復制并溶解肺癌細胞的特性，用CXCR4啟動子替換控制腺病毒復制必需基因E1A的啟動子，構建新的條件復制型腺病毒表達載體CRAd-CXCR4-GFP，并探究該載體對肺癌細胞的靶向殺傷效應。

材料和方法

1材料

293細胞株、A549細胞株、H460細胞株、H520細胞株、H1299細胞株、PAA細胞株、16HBE細胞株及腺病毒載體Ad-NULL均由廣州醫科大學病理學教研室保存;感受態大腸桿菌DH5α、質粒pMD19-CXCR4-E1A、腺病毒骨架質粒pBHG-lox-E1，3Cre及穿梭質粒pDC316-GFP及腺病毒純化試劑盒均購自深圳百恩維生物科技有限公司; T4連接酶、限制性內切酶MluⅠ和HindⅢ、PrimeScript RT Reagent Kit、CCK-8試劑盒均購自TaKaRa; Lipofectamine 2000脂質體、質粒小量抽提試劑盒、質粒大量抽提試劑盒和膠回收試劑盒均購自QIAGEN。引物合成及DNA測序由Invitrogen完成。

2方法

2.1重組質粒pDC316-CXCR4-GFP的構建和鑒定

以質粒pMD19-CXCR4-E1A為模板，PCR擴增人CXCR4-E1A序列，在引物中加入MluⅠ和HindⅢ酶切位點。利用Primer 5. 0進行引物設計: CXCR4-E1A上游引物為5’-CGGACGCGTGAAATGCCTCTGGGAGGTCCTGTCC-3’，下游引物為5’-CCCAAGCTT-

TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTC-3’，產物大小為1 301 bp。反應條件為95℃3 min; 95℃20 s，55℃30 s，72℃45 s，共30個循環;最后72℃5 min。PCR產物進行純化回收后，與穿梭質粒pDC316-GFP分別進行MluⅠ+ HindⅢ雙酶切。酶切片段回收、連接后轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行酶切鑒定，鑒定正確的重組克隆進行測序驗證。測序正確的克隆進行大規模質粒提取，用于腺病毒包裝實驗。

2.2條件復制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP的包裝與擴增重組質粒pDC316-CXCR4-GFP、骨架質粒pBHG-lox-E1，3Cre和Lipofectamine 2000脂質體共轉染293細胞進行腺病毒包裝，同時以質粒pDC316-GFP為陰性對照。每天觀察熒光表達和出毒跡象，出毒跡象為細胞收縮變圓，并伴隨有細胞脫落，待細胞大部分病變并從培養瓶壁脫落后，進行收毒，為條件復制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP母液，標記為P1。擴增培養293細胞，當細胞匯合度達到80%時，加入CRAd-CXCR4-GFP母液P1，感染60 h后收集細胞。－80℃/37℃反復凍融3次，10 000×g離心10 min收集腺病毒上清。腺病毒擴增至第3代( passage 3，P3)時，用腺病毒純化試劑盒純化P3病毒。

2.3CRAd-CXCR4-GFP的鑒定與滴度測定收集P3代病毒，沸水孵育10 min后立即冰浴。短暫離心后取上清用于PCR鑒定模板。特異性引物、擴增體系和條件同材料和方法2，同時用pDC316-CXCR4-GFP作為陽性對照。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。在腺病毒滴度測定前1 d取48孔板，每孔加入3×104個293細胞，用DMEM培養基10倍梯度稀釋腺病毒，經48 h感染，利用熒光顯微鏡計數熒光細胞情況。在最高稀梯度m的孔數出n( n＜10)個帶熒光的細胞，則腺病毒滴度為n×10m +3/L( m為稀釋梯度)，若n＞10，則需繼續稀釋。

2.4Real-time PCR檢測5種肺癌細胞株CXCR4 mRNA表達用Trizol法提取A549細胞、H460細胞、H520細胞、H1299細胞、PAA細胞和16HBE細胞總RNA，按照RT試劑盒說明書進行逆轉錄反應。利用Primer 5. 0進行熒光定量引物設計，CXCR4上游引物為5’-CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG-3’，下游引物為5’-ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG-3’，產物99 bp; GAPDH為5’-AAATCTGGCACCACACCT-3’，下游引物為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，產物145 bp。使用7500熒光定量PCR儀進行擴增反應，按照real-time PCR試劑盒說明書進行定量分析，CXCR4的擴增條件為95℃3 min; 95℃45 s，57℃60 s，72℃30 s，共40個循環;最后72℃5 min; GAPDH的擴增條件同CXCR4。每個樣品設3個復孔。以表達倍數=2－ΔΔCt表示基因的表達量，計算表達倍數，實驗重復3次。

2.5CXCR4啟動子在A549細胞內活性的檢測將1. 5×106個A549細胞鋪于6孔板，細胞密度長至70%時，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實驗組)和Ad-NULL(空載體組)，同時加入500 μL無血清DMEM培養基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，轉染48 h后提取各組細胞RNA。按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應。利用Primer 5. 0進行熒光定量引物設計，E1A上游引物為5’-CCTCCTAGCCATTTTGAACCAC-3’，下游引物為5’-GCACCGCCAACATTACAGAG-3’，產物124 bp。使用7500熒光定量PCR儀進行擴增反應，按照realtime PCR試劑盒說明書進行定量分析，E1A與GAPDH的擴增條件及定量分析同上，每個樣品設3個復孔。

2.6重組載體轉染A549細胞后腺病毒復制數的檢測將1. 5×106個A549細胞鋪于6孔板，細胞密度長至70%時，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實驗組)和Ad-NULL(空載體組)，同時加入500 μL無血清DMEM培養基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基;轉染48 h后提取各組細胞DNA。利用Primer 5. 0進行熒光定量引物設計，E4上游引物為5’-CAAGCGCAGGTAGATTAAAGTGG-3’，下游引物為5’-GGTTTAGGATGGTGGTGGATG-3’，產物127 bp。使用7500熒光定量PCR儀進行擴增反應，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行定量分析，E4與GAPDH的擴增條件及定量分析同上。

2.7重組載體體外功能檢測將1. 5×106個A549 和16HBE細胞鋪于6孔板，細胞密度長至70%時，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實驗組) 和Ad-NULL(空載體組)，并設空白對照組。同時加入500 μL無血清DMEM培養基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基;分別在轉染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，使用胰酶消化細胞，離心收集細胞;加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，置流式細胞儀檢測，實驗重復3次。將1×104個A549和16HBE細胞鋪于96孔板，細胞密度長至70%時，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實驗組)和Ad-NULL(空載體組)，并設空白對照組。同時加入500 μL無血清DMEM培養基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基;分別在轉染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，加入10 μL CCK-8溶液，然后置于培養箱孵育1 h;將96孔板置于酶標儀450 nm波長處測定吸光度( A)，實驗重復3次。

3統計學處理

所用數據采用SPSS 16. 0軟件進行處理，所得數值以均數±標準差( mean±SD)表示，兩組間均數比較用t檢驗進行處理，多組間均數比較用單因素方差分析，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1 重組質粒pDC316-CXCR4-GFP的構建和鑒定

PCR擴增CXCR4-E1A序列，產物純化后與載體pDC316-GFP進行雙酶切、連接和轉化，得到數十個克隆。挑取4個克隆，小量搖菌后進行鑒定，結果顯示其中1、2和4出現約1 301 bp和5 885 bp兩條帶，可能為陽性克隆(圖1)。經測序鑒定與GenBank提供的序列一致，重組質粒pDC316-CXCR4-GFP構建成功。

Figure 1.The identification of pDC316-CXCR4-GFP by enzymedigestion.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1～4: pDC316-CXCR4-GFP digested by MluⅠand HindⅢ.圖1　pDC316-CXCR4-GFP的酶切鑒定結果

2 CRAd-CXCR4-GFP的包裝

重組質粒pDC316-CXCR4-GFP和骨架質粒pBHG-lox-E1，3Cre共轉染293細胞，并以pDC316-GFP作為陰性對照。24 h后熒光顯微鏡下觀察293細胞發出綠色熒光。因為pDC316-CXCR4-GFP分子量比pDC316-GFP大，所以轉染效率較后者低，熒光表達較弱。隨著轉染細胞的傳代，熒光細胞越來越少，但是pDC316-CXCR4-GFP轉染293細胞后第11天，熒光細胞呈現片狀，說明已包裝出P1腺病毒，而pDC316-GFP轉染293細胞后則無熒光擴增現象，說明沒有包裝出腺病毒，見圖2。

Figure 2.The package of the first generation of adenovirus after 293 cells transfected with pDC316-CXCR4-GFP (×10).圖2　pDC316-CXCR4-GFP從轉染后到獲得P1腺病毒的綠色熒光圖

3 CRAd-CXCR4-GFP的鑒定與滴度測定

從CRAd-CXCR4-GFP的P3樣品中可以檢測到1 301 bp的條帶，表明目的基因已成功整合在重組腺病毒基因組中(圖3)。用本文所述方法測得CRAd-CXCR4-GFP滴度為1×1013PFU/L。

4 5種肺癌細胞株CXCR4的表達

結果顯示，在5種肺癌細胞株中，A549細胞CXCR4表達最高，見圖4。

5 CXCR4啟動子在A549細胞內活性

各組轉染A549細胞48 h后，實驗組的E1A mRNA表達較空載體組明顯增強( P＜0. 01)，見圖5。

6 CRAd-CXCR4-GFP轉染A549細胞后的腺病毒復制數

各組轉染A549細胞48 h后，實驗組的E4 mRNA表達較空載體組明顯增強( P＜0. 01)，見圖6。

Figure 3.The CRAd-CXCR4-GFP identified by PCR.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1: pDC316-CXCR4-GFP as the template; Lane 2: CRAd-CXCR4-GFP diluted 10 times as the template.圖3　CRAd-CXCR4-GFP P3代病毒的PCR鑒定結果

Figure 4.The expression of CXCR4 mRNA in 6 kinds of lung cancer cell lines detected by real-time PCR.Mean± SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs other cell lines.圖4　Real-time PCR檢測6種肺癌細胞株CXCR4的mRNA表達

Figure 5.The mRNA expression of E1A detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.圖5　Real-time PCR檢測E1A的mRNA表達

7 CRAd-CXCR4-GFP的體外功能

流式細胞儀檢測顯示，各組轉染A549細胞后，與空載體組和空白對照組相比，實驗組前4 d細胞凋亡率無明顯差異，第5天凋亡率明顯增加( P＜0. 01)，CCK-8實驗亦顯示，與空載體組和空白對照組相比，實驗組前4 d細胞活性率無明顯差異，第5天活性率明顯降低( P＜0. 01)，見圖7、8。各組間5天內16HBE細胞的凋亡率和細胞活性率均無明顯變化，見圖9、10。

Figure 6.The mRNA expression of E4 detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.圖6　Real-time PCR檢測E4 mRNA的表達

Figure 7.The apoptotic rate of A549 cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.圖7　流式細胞術檢測轉染不同時間A549細胞的凋亡情況

Figure 8.The viability of A549 cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.圖8　CCK-8檢測轉染后不同時間A549細胞活性的變化

討論

惡性腫瘤的基因治療是當今的研究熱點。腺病毒載體以其轉染效率高，轉染細胞類型廣泛，不整合到宿主染色體等特點而成為常用的基因載體。目前主要有3種腺病毒系統，包括AdEasy系統、AdMax系統和Adeno-X系統。AdMax包裝系統的重組過程發生在293細胞，與其它2種系統相比，避免了在細菌中重組，因此該系統操作簡便、重組效率較高和目的基因的表達水平高(系統中的mCMV啟動子比CMV啟動子強若干倍)［3-4］。我們利用AdMax包裝系統成功構建了條件復制型腺病毒載體CRAd-CXCR4-GFP，酶切鑒定和測序鑒定證明了CXCR4-E1A基因成功整合進重組腺病毒基因組，重組質粒在轉染293細胞11 d后包裝出P1腺病毒并進行病毒的擴增，測定病毒滴度為1×1013PFU/L，可用于后續的體外實驗。

Figure 9.The apoptotic rate of 16HBE cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n =3.圖9　流式細胞術檢測轉染后不同時間16HBE細胞的凋亡情況

Figure 10.The viability of 16HBE cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n =3.圖10　CCK-8檢測轉染后不同時間16HBE細胞活性的變化

條件復制型腺病毒的生活周期包括:轉染靶細胞→外源基因表達→復制→溶瘤→子代腺病毒釋放→重復感染，每個階段的效率都與其抗癌效應密切相關［5］。CXCR4啟動子是腺病毒的復制開關，因此細胞內CXCR4的表達決定了腺病毒的復制能力以及由腺病毒導致的靶向溶瘤作用。本研究中，我們首先利real-time PCR方法從5種肺癌細胞株篩選出CXCR4高表達的A549細胞株，作為靶細胞用于后續研究。

Zhu等［2］構建的CRAd-CXCR4. RGD已在體內外證明了該載體對肺癌較強的靶向性和較低的肝毒性，那我們構建的CRAd-CXCR4-GFP轉染A549細胞后，CXCR4是否可以啟動腺病毒的復制呢?我們將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉染A549細胞，采用real-time PCR方法檢測E1A mRNA的表達情況，可見A549細胞中E1A mRNA呈現高表達，說明CXCR4啟動子在A549細胞內具有較高的啟動活性。Kim等［6］已證明少量的E1A表達就能滿足腺病毒的復制。

腺病毒的復制數決定了條件復制型腺病毒的溶瘤能力，E1A的表達只能反映腺病毒在靶細胞內有無復制，并不能體現腺病毒具體的復制拷貝數。目前多采用檢測E4的表達來反映腺病毒具體的復制能力［7］。本研究采用熒光定量PCR檢測分別轉染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549細胞的E4表達水平，可見在A549細胞中E4呈高表達，表明CRAd-CXCR4-GFP轉染A549細胞后病毒具有強大的復制能力。

強大的復制能力保證了溶瘤腺病毒功能的實現。我們利用流式細胞儀對分別轉染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549細胞和16HBE細胞的凋亡情況進行檢測，與空載體組和空白對照組相比，CRAd-CXCR4-GFP組前4 d細胞凋亡率無明顯差異，第5天凋亡率明顯增加，CCK-8實驗亦顯示，實驗組前4 d細胞活性率無明顯差異，第5天活性率明顯降低。結果表明CRAd-CXCR4-GFP轉染A549細胞后腺病毒在細胞內大量復制，第5天時復制的腺病毒引起了細胞的大量壞死。那本研究構建的溶瘤病毒是否具有腫瘤細胞靶向性?我們采用流式細胞儀與CCK-8-檢測方法，同時對分別轉染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL的永生化支氣管上皮細胞16HBE進行檢測，結果顯示各組間5 d內16HBE細胞的凋亡率和細胞活性率均無明顯變化，而相同條件轉染的A549細胞可見發生了細胞的大量死亡，說明CXCR4啟動子的條件復制型腺病毒能夠發揮靶向溶解肺癌細胞的作用。國內外已有大量實驗證明CXCR4啟動子的腫瘤靶向性。Chu等［8］證明了構建的Ad5/3-CXCR4-E1A能特異性溶解胰腺癌細胞，而對正常胰腺細胞無毒性; Rajendran等［9］指出CXCR4啟動子的條件復制型腺病毒對乳腺癌細胞具有靶向殺傷效應;在卵巢癌的研究中亦有相似的報道［10］，由此說明了CXCR4啟動子的廣譜性，其有望應用于多數腫瘤的臨床治療。

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Conditionally replicating adenovirus activated by CXCR4 promoter in lung cancer

LI Long-guang，LI Shu-hua，WANG Hong-yan，LONG Jie，XIE Xiao-bin，ZHANG Ya-jie
( Department of Pathology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China.E-mail: yajie.zhang@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To construct a conditionally replicating adenovirus vector activated by CXCR4 promoter and to evaluate its ability of lysing the lung cancer cells specifically.METHODS: Human CXCR4-E1A gene amplified by PCR was cloned into the shuttle plasmid pDC316-GFP to construct the recombinant shuttle plasmid pDC316-CXCR4-GFP.The recombinat shuttle plasmid and adenovirus genomic plasmid pBHG-lox-E1，3Cre were transfected into 293 cells to construct the recombinant adenovirus CRAd-CXCR4-GFP.PCR was used to detect the target gene fragments，and the viral titer was determined.A549 cells with the highest mRNA expression of CXCR4 were screened out from 5 kinds of lung cancer cell lines by real-time PCR.CXCR4 promoter activity and adenovirus replication numbers were detected in A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL.CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL were transfected into A549 cells and 16HBE cells，the apoptotic rates were detected by flow cytometry and the viability was analyzed by CCK-8 assay.RESULTS: The recombinant plasmid pDC316-CXCR4-GFP was constructed successfully.Green fluorescence was observed in 293 cells under fluorescent microscope after co-transfection of pDC316-CXCR4-GFP and pBHG-lox-E1，3Cre at 11 d.Green fluorescence was observed in 293 cells after infection of amplified 3rd generational adenovirus.PCR showed that the purpose gene was successfully integrated in recombinant adenovirus genome.The virus in the supernatant reached a titer of 1×10(13)PFU/L.The mRNA expression of E1A and E4 in the A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP was markedly increased compared with Ad-NULL group.Compared with Ad-NULL group and empty control group，the apoptoticbook=1204,ebook=60rate and the viability of A549 cells in CRAd-CXCR4-GFP group had no significant difference in the first 4 d，the apoptotic rate increased significantly at 5 d，and the cell viability declined significantly at 5 d，but the apoptotic rate and the viability of 16HBE cells in each group had no significant difference within 5 days.CONCLUSION: The conditionally replicating adenovirus vector CRAd-CXCR4-GFP has been successfully constructed，which has the ability of lysing lung cancer cells specifically.

［KEY WORDS］Conditionally replicating adenovirus; Tumor-specific promoter; CXCR4 promoter

通訊作者△Tel: 020-81340347; E-mail: yajie.zhang@163.com

*［基金項目］教育部博士點基金博導類課題( No.20134423110001) ;廣東省自然科學基金資助項目( No.S2012010010181) ;廣州市科技計劃( No.2014Y2-00171) ;廣州市教育系統創新學術團隊項目( No.13C06)

［收稿日期］2014-06-16［修回日期］2015-04-20

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1203-06

［中圖分類號］R392. 12

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.009