應用噬菌體展示肽庫技術淘選大鼠CCR5膜外第一、二胞外環特異性結合的活性拮抗肽與初步鑒定*

劉思雪，胡　梅，葉小研，黃花榮，鐘英強(中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科，兒科，廣東廣州500;廣東藥學院附屬第一醫院消化內科，廣東廣州50080)

應用噬菌體展示肽庫技術淘選大鼠CCR5膜外第一、二胞外環特異性結合的活性拮抗肽與初步鑒定*

劉思雪1▲，胡梅1▲，葉小研1，3，黃花榮2△，鐘英強1△
(中山大學孫逸仙紀念醫院1消化內科，2兒科，廣東廣州510120;3廣東藥學院附屬第一醫院消化內科，廣東廣州510080)

［摘要］目的:利用噬菌體展示肽庫技術淘選與大鼠CC趨化因子受體5( CCR5)膜外第一、二胞外環特異性結合的短肽，并鑒定其與CCR5的結合能力。方法:在蛋白質數據庫中查得大鼠CCR5第一、二胞外環的氨基酸序列，合成相應的線性短肽作為淘選的靶分子，利用噬菌體展示7肽文庫進行3～4輪淘選，用ELISA法鑒定所選肽與靶分子的結合，并測定其與濃度的關系。結果:與CCR5第一、二胞外環特異性結合的噬菌體展示的短肽序列分別為GHWKVWL和HYIDFRW，ELISA鑒定呈陽性反應，且短肽與靶分子的結合具有濃度依賴性和可飽和性。結論:利用噬菌體展示技術成功獲得了2條CCR5特異性結合的短肽，并在體外證明其可與CCR5第一、二胞外環具有結合能力。

［關鍵詞］CC趨化因子受體5;拮抗肽;噬菌體展示

▲并列第1作者

CC趨化因子受體5( CC chemokine receptor 5，CCR5)是趨化因子受體超家族的重要成員之一，屬于G蛋白偶聯受體，具有典型的7次跨膜區段( transmembrane region)和3個胞外環( extracellular loop，ECL)及3個胞內環( intracellular loop，ICL)，其胞外部分可與配體結合而發揮相應的生物學效應［1］。CCR5主要分布于炎癥細胞表面，如淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞等，參與炎癥細胞在體內的趨化性遷移，在炎癥性腸病( inflammatory bowel disease，IBD)的免疫炎癥反應中起重要作用，其可能為IBD治療的新靶點［2］，而針對CCR5的各類拮抗劑可用于人類多種自身免疫性疾病、器官移植后排斥反應和艾滋病等的治療，具有廣闊的應用前景。我們擬應用噬菌體展示技術淘選能與大鼠CCR5第一、二胞外環特異性結合的活性拮抗短肽，并在體外對其結合能力作了初步鑒定。

材料和方法

1主要材料和試劑

噬菌體表面展示肽庫試劑盒Ph.D.TM-7(隨機7肽庫)購自New England BioLabs，庫容1×1016pfu/L，宿主菌E.coli ER2738，-96 gⅢ測序引物5’-OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase，HRP)標記的抗M13單克隆抗體( HRP/anti-M13)購自GE Healthcare。HRP底物2，2-聯氮-二( 3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽［2，2-azino-bis( 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS］購自Sigma。大鼠CCR5第一、二胞外環( ECL1、ECL2)的氨基酸序列在OWL蛋白質數據庫中查得，ECL1為AANEW VFGNI MCK ( 13 aa)，ECL2為MRSQK EGSHY TCSPH FLHIQ YRFWK HFQTL KM ( 32 aa)，交由中國上海吉爾生化有限公司合成，純度為95%。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷( isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG) 和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)即用型溶液購自AMRESCO。

2方法

2.1親和淘選分別將ECL1和ECL2凍干粉溶于0.1 mmol/L pH 8.6的NaHCO3溶液，ECL1用1%二甲基亞砜( dimethylsulfoxide，DMSO)助溶，制備100 μg/L的靶分子溶液包被6孔板，每孔0.5 mL，在增濕容器中4℃輕微振蕩，孵育過夜。第2天倒掉包被液，加滿封閉液( 1 mol/L pH 8.6 NaHCO3+5 g/L BSA)，4℃作用1 h。去除封閉液，用TBST緩沖液快速洗板6次。用350 μL的TBST緩沖液稀釋2 ×1011pfu的噬菌體，加到已包被好的孔中，室溫溫和搖動60 min。TBST緩沖液洗板10次，加入非特異性緩沖液( 0.2 mol/L pH 2.2的glycine-HCl +1 g/L BSA) 350 μL，室溫作用15 min，將洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，用50 μL 1 mol/L Tris-HCl( pH 9.1)中和上述洗脫液。取1 μL測定洗脫物的滴度。剩余洗脫物加入20 mL ER2738培養物中(菌體應處于對數前期，A600=0. 01～0. 05)，37℃劇烈搖動培養4. 5 h。將擴增培養物經聚乙二醇( polyethylene glycol，PEG) /NaCl兩次濃縮純化后得到噬菌體擴增液，測定其滴度后可進行下一輪淘選。如此共進行3輪淘選，若第3輪淘選后沒有明顯的共有序列發現，按說明書要求繼續擴增進行第4輪淘選。其后的淘選中噬菌體投入量均為2×1011pfu，TBST洗滌濃度增至0.5%。

2.2噬菌體滴度測定接種ER2738單菌落于10 mL LB培養基中，搖床培養5 h至對數中期( A600≈0. 5)。用LB系列稀釋噬菌體，淘選洗脫物稀釋度為101～104;擴增后為108～1011。取10 μL稀釋的噬菌體與200 μL菌液混勻，37℃放置5 min，再將上述混合液與3 mL 45℃預熱的頂層瓊脂( LB培養基+7 g/L瓊脂粉+1g/L MgCl2·6H2O)混勻，立即平鋪于37℃預溫的LB/IPTG/X-Gal平板( LB培養基+15 g/L瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70℃時加入1 mL IPTG/X-Gal即用型溶液)上，冷卻后倒置于37℃細菌培養箱中過夜。第2天檢查平板，計數有約100個藍色噬菌斑的平板上的斑數，乘以稀釋倍數即為每10 μL噬菌體的滴度。

2.3噬菌斑擴增測序挑一ER2738單克隆于LBTet培養基中培養過夜，將過夜培養物按1∶100稀釋接種于LB培養基，分1 mL到每一個培養管中。在第3輪淘選洗脫物滴度測定的平板中，在總量不到100個噬菌斑的平板上隨機挑取15個克隆，分別接種到培養管中。37℃搖床培養4.5 h。14 000 r/min離心30 s，上清液轉入新鮮離心管中，再離心，取80%的上清到另一離心管，即為擴增的噬菌體貯液。取200 μL由中國北京金唯智生物科技有限公司完成測序，測序成功的標準:讀取序列長度大于800 bp，背景峰高度不高過主峰的1/3。

2.4ELISA鑒定陽性噬菌體克隆將過夜培養的ER2738按1∶100稀釋于20 mL LB培養基，于每管加入5 μL測序剩余的噬菌體上清，37℃通氣培養4.5 h，PEG/NaCl兩次濃縮純化后得到噬菌體擴增液。測定噬菌體滴度。制備100 mg/L的ECL1、ECL2靶分子溶液(方法同淘選步驟)包被96孔酶標板，150 μL/孔，每個待鑒定克隆1個包被孔及1個空白對照孔，4℃孵育過夜。第2天去除殘液，加滿封閉液4℃作用1.5 h。甩出封閉液，TBST洗板6次。包被孔和空白對照孔各加入5 μL噬菌體擴增液，0.5% TBST稀釋至100 μL，室溫振蕩作用1.5 h。0.5% TBST洗板6次，每孔加入200 μL HRP/anti-M13抗體( 1∶5 000稀釋)，室溫振蕩作用1 h。0.5% TBST洗板6次，每孔加200 μL顯色底物ABTS-H2O2溶液，室溫作用30 min，酶標儀讀取405 nm處的吸光度。每項實驗重復3次，陽性克隆定義為反應孔吸光值高于陰性對照3倍［3-4］。

2.5ELISA檢測噬菌體濃度與其結合能力的關系

將含有共有序列的噬菌體克隆進行擴增并測定滴度，在一個已封閉的酶標板中稀釋噬菌體，第1孔加入約含5×1011個病毒子的噬菌體懸液，TBS稀釋至200 μL，吸取100 μL至第2孔，按此方法依次進行2倍系列稀釋。將稀釋好的噬菌體全部轉移至包被有靶分子的酶標板中，進行定量ELISA，方法同2.4，分別讀取不同濃度的噬菌體與靶分子結合后的吸光度。

3統計學處理

定量數據以均值±標準差( mean±SD)表示，兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗。應用SPSS 13.0統計學軟件分析處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 親和淘選與CCR5第一、二胞外環特異性結合的噬菌體

以人工合成的CCR5第一、二胞外環氨基酸序列作為靶分子，對噬菌體7肽庫進行淘選，隨著篩選輪次的增加，從固相平板洗脫的噬菌體數逐漸增加，回收率(回收/投入噬菌體量)逐輪升高，ECL1和ECL2特異性結合的噬菌體得到了選擇性富集，見表1。將第3輪淘選洗脫物測序后發現，ECL1已得到共有序列( 10/15)，而ECL2的一致率較低( 3/15)，故ECL2增加了第4輪淘選，共有序列即明顯出現( 11/15)。

表1　不同淘選輪次噬菌體淘選的回收率Table 1.Recovery rate of phages for each round of panning

2 淘選所得噬菌體克隆的氨基酸序列分析

最后一輪淘選物滴度測定時，從總量不到100個藍色噬菌斑的平板上隨機挑取15個克隆擴增后測序，根據測序結果推斷噬菌體展示的氨基酸序列。ECL1和ECL2分別有10和11個噬菌體序列一致，見表2。其共有序列分別為GHWKVWL和HYIDFRW，基因測序圖見圖1、2。

表2　淘選所得噬菌體克隆的氨基酸序列Table 2.Exogenous amino acid sequences of selected phage clones

3 ELISA法鑒定噬菌體克隆與ECL1、ECL2的特異性結合

Figure 1.Gene sequencing of consensus peptide displayed on ECL1-specifically bound phage.圖1　ECL1特異性結合噬菌體克隆所展示的共有結合肽的基因測序圖

Figure 2.Gene sequencing of consensus peptide displayed on ECL2-specifically bound phage.圖2　ECL2特異性結合噬菌體克隆所展示的共有結合肽的基因測序圖

將噬菌體上清液擴增后做ELISA檢測，除空白對照外，每個克隆均設置陰性對照(不包被靶分子、僅用牛血清白蛋白溶液進行封阻)。ECL1結合的15個噬菌體克隆中，有4個為陰性克隆( P＞0. 05，或噬菌體A值＜陰性對照A值×3) ; 11個為陽性克隆( P＜0. 05，并且噬菌體A值＞陰性對照A值×3)，其中10個氨基酸序列為GHWKVWL，1個WHLSSWK，見表3。ECL2結合的15個噬菌體克隆全部為陽性克隆，其中11個氨基酸序列為HYIDFRW，2個 WSLSELH，1個QFWYFHP，1個LYADSVL，見表4。

表3　ELISA法鑒定ECL1淘選所得噬菌體克隆的結合能力Table 3.Identification of binding efficiency of selected phage clones targeting ECL1 by ELISA ( Mean±SD.n =3)

表4　ELISA法鑒定ECL2淘選所得噬菌體克隆的結合能力Table 4.Identification of binding efficiency of selected phage clones targeting ECL2 by ELISA ( Mean±SD.n =3)

4 共有序列噬菌體克隆與靶分子的結合能力與濃度的關系

與ECL1和ECL2特異性結合的共有序列為GHWKVWL和HYIDFRW，將其對應的噬菌體克隆進行擴增，進行定量ELISA檢測。結果表明，在噬菌體濃度較低時，其與靶分子的結合能力隨濃度的增加呈線性上升趨勢;當濃度達到3.125×1014pfu/L(第3孔)及以上時，其與靶分子的結合達到飽和，見圖3。

Figure 3.Relationship of concentration and binding efficiency of phage clones.Mean±SD.n =3.圖3　噬菌體濃度與結合能力的關系

討論

噬菌體展示技術是一種選擇技術，它利用基因重組的方法將大量隨機多肽與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，將其展示在病毒顆粒的表面，在體外通過親和淘選的方法，可將與靶分子特異性結合的噬菌體從肽庫中淘選出來，經擴增后進行序列測定可確定表達的肽的氨基酸序列。該技術是蛋白質組學研究中的一種常用方法，可廣泛用于確定抗原表位、確定蛋白質相互作用位點、鑒定酶的底物或抑制物、鑒定受體激活物或抑制劑、開發多肽藥物、研制腫瘤疫苗等。

在本實驗中，我們首先進行了常規的3輪淘選，在洗脫物培養平板上，隨機選取15個獨立克隆進行測序，發現ECL1有10個克隆所展示的外源肽序列完全一致，說明特異性短肽已得到選擇性富集，淘選成功。而ECL2的15個測序克隆中僅有3個序列一致，其它12個各不相同，增加了第4輪淘選后發現，相同的序列一致率從3/15上升到11/15，認為淘選成功，這可能與ECL2氨基酸序列長、與其親和力高的短肽多而需要更強的淘選有關。

淘選得到的短肽應用ELISA法進行驗證，發現除了共有序列外，其它非特異性的序列也可表現出陽性反應，說明與CCR5第一、二胞外環有親和力的7肽并不唯一，特別是具有32個氨基酸長度的ECL2，能與其隨機結合的七肽種類很多，而淘選之所以能使一種序列呈明顯優勢，是因為這種短肽與靶分子的結合作用最強，能在數輪的洗脫中“幸存”下來。另外，我們將這6種陽性的多肽序列通過Gen-Bank的BLAST序列比對工具，在RefSeq protein數據庫中進行同源性搜索，未發現其與大鼠趨化因子具有同源性，說明它們與CCR5第一、二胞外環的結合可能是通過模擬趨化因子的構象表位而發揮作用的。噬菌體濃度定量的ELISA實驗中發現，噬菌體在體外與CCR5的親合力具有濃度依賴性和可飽和性，這跟受體與配體結合具有可飽和性的理論一致，推測飽和的主要原因是靶分子包被的數目有限。

在噬菌體展示肽庫的選擇上，美國New England Biolabs公司有7肽庫( Ph.D.TM-7)、12肽庫( Ph.D.TM-12)和環7肽庫( Ph.D.TM-C7C) 3種可供選擇。當配體序列要求在一個短的區域內有幾個結合位點時，Ph.D.TM-7肽文庫更好一些;當配體序列不能以足夠強的親和力與靶分子結合而被篩選時，Ph.D.TM-C7C文庫會更好一些，因為此文庫中所有展示肽結構均被局限于1個7殘基二硫環內，其結合構象比線性形式表達的肽文庫更有效、結合更緊密;而Ph.D.TM-12肽文庫提供了更大的隨機區域，會有利于選擇到有多個弱結合位點的序列，而不是只有少數幾個強結合位點的序列。因此，由于我們的實驗是以相對較短的線性氨基酸( 13 aa和32 aa)作為靶分子，淘選是為得到高親和力、高特異性的短肽，故選擇使用了結合位點密集、需要強淘選的7肽庫。Wang等［5］以細胞表達的人CCR5作為靶分子，用12肽庫也淘選到與其特異性結合的親和短肽，并在細胞水平上初步證明了該十二肽對其天然配體RANTES及CCR5單克隆抗體有競爭性結合作用，這項實驗以CCR5整體結構作為靶點，12肽庫的選擇則可能更有利于特異性的提高。

研究顯示CCR5主要表達于炎癥細胞表面，其天然配體包括趨化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β，CCR5的N端及第二胞外環是其與配體結合的主要位點［6-7］，結合后可誘導炎癥細胞向特定組織和器官趨化遷移，從而參與機體免疫反應，并在變態反應性疾病中發揮重要作用，如IBD［8］、多發性硬化［9］、類風濕性關節炎［10］等。另外，CCR5還是HIV-1感染靶細胞的輔助受體，已成為抗艾滋病藥物研發的理想靶點之一［11］。在CCR5拮抗劑的研發方面，小分子藥物馬拉維諾是目前FDA唯一批準用于臨床的CCR5拮抗劑，主要用于艾滋病的治療。其它類型的CCR5拮抗劑包括趨化因子衍生物、單克隆抗體及肽類化合物等，尚在實驗室研究階段，有許多已在實驗室證明有效或進入I期臨床試驗［12］，本實驗淘選的親和短肽即屬于肽類拮抗劑一類，這類多肽具有高親和力和特異性結合的特點，生產成本低、穩定性好、副反應發生率低，是蛋白制劑的一種可靠替代品，具有很大的研發空間。

在IBD的發病機制中，CC趨化因子與相應的受體結合后可觸發多種炎癥反應，包括白細胞的激活、趨化、胞吐作用，產生基質金屬蛋白酶降解基質、上調炎癥的級聯反應等。研究證明IBD患者病變黏膜中CCR5+細胞浸潤顯著，與UC疾病活動度呈正相關［13］，并與CD患者非干酪性肉芽腫形成有關［14］。Ajuebor等［8］及Kucuk等［15］用RANTES受體拮抗劑Met-RANTES分別治療三硝基苯磺酸誘導的小鼠、大鼠結腸炎，發現病變黏膜的炎癥反應可明顯減輕、腸內細菌異位明顯下降。Katchar等［16］用MIP-3α單克隆抗體治療小鼠結腸炎后，也可發現結腸損傷明顯減輕。由此推斷，趨化因子受體拮抗劑可能是IBD治療的有效方法之一。本實驗淘選得到針對大鼠的2個CCR5拮抗短肽，可進一步在構建結腸炎的大鼠模型中來驗證其生理作用。

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Panning and identification of antagonistic active peptides specifically binding to the first and second extracellular membrane loops of rat CCR5 by technique of phage display peptide library

LIU Si-xue1，HU Mei1，YE Xiao-yan1，3，HUANG Hua-rong2，ZHONG Ying-qiang1
(1Department of Gastroenterology，2Department of Pediatric，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China.E-mail: zhongyingqiang@21cn.com; hhrvivi@21cn.com)

［ABSTRACT］AIM: To pan the active peptides which specifically bound to the first and second extracellular membrane loops of rat CC chemokine receptor 5 ( CCR5).METHODS: The technique of phage display peptide library was used and binding ability of the peptides was identified.The amino acid sequences of the first and second extracellular loops of rat CCR5 were searched in the protein database and chemically synthesized corresponding linear peptides were used as targets in the biopanning.After 3 to 4 rounds of screening with Ph.D.(TM)-7 Phage Display Peptide Library were performed，the specific phages were collected and primarily identified by ELISA.RESULTS: The sequences of the peptides displayed on the selected phages were GHWKVWL and HYIDFRW，both of them exhibited positive in phage binding ELISA and the binding to phages and targets were concentration dependent and saturable.CONCLUSION: Two antagonistic active peptides specifically binding to CCR5 were successfully obtained by the technique of phage display peptide library，and the binding ability to the first and second extracellular membrane loops of rat CCR5 were proved in vitro.

［KEY WORDS］CC chemokine receptor 5; Antagonistic peptide; Phage display

通訊作者△鐘英強Tel: 020-81332598; E-mail: zhongyingqiang@21cn.com;黃花榮020-81332446; E-mail: hhrvivi@21cn.com

*［基金項目］國家自然科學資金基助項目( No.81370499) ;廣東省自然科學基金資助項目( No.2014-A030313020)

［收稿日期］2015-03-03［修回日期］2015-04-11

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1225-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.013