硫化氫保護被ATP損傷的PC12細胞*

馬　潔，沈　慧，王　璐，宋景貴，韓亞州，李東亮△(新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室，附屬中心醫院，第三附屬醫院，第二附屬醫院，河南新鄉00;沁陽市人民醫院神經內科，河南沁陽0)

硫化氫保護被ATP損傷的PC12細胞*

馬潔1，2，沈慧1，3，王璐1，宋景貴4，韓亞州5，李東亮1△
(新鄉醫學院1生理學與神經生物學教研室，2附屬中心醫院，3第三附屬醫院，4第二附屬醫院，河南新鄉453003;5沁陽市人民醫院神經內科，河南沁陽454550)

［摘要］目的:觀察硫化氫的供體硫氫化鈉( NaHS)對三磷酸腺苷( ATP)誘導的PC12細胞活力、胞內Ca(2 +)濃度(［Ca(2 +)］i)及膜通透性的變化，探討硫化氫神經保護作用的嘌呤信號機制。方法:將對數生長期高分化的PC12細胞，隨機分為4組，分別為( 1)正常對照組:常規培養，不進行ATP處理; ( 2) ATP組:接種細胞24 h后ATP處理; ( 3) NaHS + ATP組: NaHS預先孵育30 min后再用ATP處理，并且NaHS始終存在于反應體系中; ( 4) KN-62 ( P2X7受體阻斷劑) + ATP組: KN-62預先孵育30 min，其余同NaHS + ATP組。MTT檢測各組細胞活力，Fura-2/ AM熒光染料檢測各組［Ca(2 +)］i，檢測熒光染料YO-PRO-1的相對熒光單位以反映膜的通透性。結果: ( 1) 0. 3 mmol/L ATP對細胞活力無影響，但1、3、5、10 mmol/L ATP則呈濃度依賴式明顯降低細胞活力，200 μmol/L NaHS干預可明顯逆轉ATP引起的細胞活力下降( P＜0. 05)，而800 μmol/L NaHS預處理則加劇ATP對PC12細胞的損傷( P＜0. 05)。( 2) ATP處理PC12細胞會引起［Ca(2 +)］i迅速升高并且呈濃度依賴性，NaHS預處理能對抗ATP引起的［Ca(2 +)］i升高( P＜0. 05)。( 3)隨著ATP濃度的增加及作用時間的延長，PC12細胞內YO-PRO-1的熒光強度顯著增加，NaHS預處理可明顯減少細胞對YO-PRO-1的攝取( P＜0. 05)。結論:硫化氫可保護ATP損傷的PC12細胞，可能與其抑制［Ca(2 +)］i升高和YO-PRO-1熒光增強有關。

［關鍵詞］三磷酸腺苷;硫化氫;嘌呤P2X7受體; PC12細胞

近年來三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP) -P2X嘌呤信號途徑在腦缺血-再灌注損傷中的作用逐漸受到關注，而對P2X7受體亞型的研究則成為焦點。在正常生理狀態下，ATP作用于P2X7受體并將其激活，引起Ca2 +和Na+內流，K+外流，細胞去極化。而在腦缺血-再灌注損傷時，損傷的神經元和膠質細胞釋放大量的ATP［1］，這些高濃度的ATP持續地刺激P2X7受體，不僅使神經元去極化的內向電流振幅隨時間增強［2］，而且可形成大的“膜孔”，900 Da以下的各種物質(如NMDG+、YO-PRO-1和ethidium)都可以自由通過［3］，此后進一步引起活性氧、谷氨酸、ATP等炎性物質的釋放及炎性體的生成，導致細胞水腫，空泡形成，甚至凋亡和壞死，造成腦、神經組織的繼發性損傷［4］。胞外高濃度的ATP是“死亡因子”的理念已經被研究者普遍認可，近年來的研究報道也相繼證實了ATP的損傷作用［5］。

關于硫化氫( hydrogen sulfide，H2S)抗缺血-再灌注損傷的機制目前有幾種說法，如激活KATP通道說、抑制興奮毒說、抗氧化說等。而本實驗室前期的研究結果證實了ATP損傷PC12細胞與P2X7受體有關，本文則關注H2S對ATP損傷PC12細胞保護作用機制及其關鍵分子靶點，試圖為H2S的臨床應用提供一些實驗證據。

材料和方法

1細胞系和主要試劑

PC12細胞購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

MTT、ATP、H2S供體硫氫化鈉( sodium hydrosulfide，NaHS)、P2X7受體阻斷劑KN-62和DMEM培養基均購自Sigma; Fura-2/AM購自Dojindo; YO-PRO-1 Iodide購自Invitrogen;胎牛血清購自HyClone。

2方法

2.1母液及工作液配制ATP用無菌三蒸水配成500 mmol/L的母液，NaHS用無菌三蒸水配成50 mmol/L的母液。KN-62用無菌DMSO配成1 mmol/ L的母液。上述各母液分裝后避光于－20℃保存，在使用前配成適宜濃度的工作液。

2.2細胞培養及實驗分組PC12細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2培養箱中常規培養。實驗取對數生長期細胞進行，分為正常對照組( DMEM培養基常規培養)、ATP組(接種細胞24 h后用ATP處理)、NaHS + ATP組( NaHS孵育30 min后再用ATP處理，并且NaHS始終存在于反應體系中)和KN-62 + ATP組( KN-62預先孵育30 min，其余同NaHS + ATP組)。

2.3MTT檢測細胞活力對數生長期的細胞消化后，稀釋為5×105/L密度的細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中。按照上述方法分組，每組設5個復孔，藥物按預定作用時間處理后，加入以PBS配制的濃度為5 g/L的MTT 10 μL，以上配液及加藥過程均需避光操作。37℃培養箱中孵育4 h后取出培養板，吸去孔內培養基，每孔加入DMSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀波長為490 nm處測量各孔的吸光度( A)。根據下列公式計算各組細胞活力:活力( %) = ( A處理組－A空白組) /( A對照組－A空白組)×100%，實驗重復3次。

2.4細胞內鈣離子濃度( intracellular Ca2 +concentration，［Ca2 +］i)的測定取對數期生長的細胞，以2 ×105/L的細胞密度接種于35 mm的培養皿中，24 h后各組細胞按分組的描述進行處理。5 μmol/L的Fura-2/AM孵育30 min后常規洗滌，HBSS孵育30 min，使用具有Ca2 +成像系統的熒光顯微鏡檢測ATP引起的［Ca2 +］i變化，［Ca2 +］i以340 nm熒光強度與380 nm熒光強度( F340/F380)的比值來計算。

2.5YO-PRO-1攝入實驗檢測膜孔形成細胞膜孔形成時分子量為629 Da的YO-PRO-1可進入細胞與核酸結合發出綠光，因此可根據熒光強度反映膜孔開放的程度。YO-PRO-1與ATP同時加入各組，使YO-PRO-1溶液的終濃度為2 μmol/L。37℃孵育1 h，此后使用多功能酶標儀檢測(激發波長485 nm，發射波長516 nm)。YO-PRO-1熒光強度= A實驗組/ A對照組×100%。本實驗將對照組細胞攝取的熒光強度定為100%。

3統計學處理

數據以均數±標準誤( mean±SEM)表示，采用SPSS統計軟件進行處理，多組間顯著性檢驗用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1 ATP誘導的PC12細胞活力的變化

以空白對照組細胞活力設為100%，0. 3、1、3、5 和10 mmol/L ATP作用3 h后，PC12細胞活力分別為98. 7%、87. 5%、83. 0%、80. 4%和72. 4%，除0. 3 mmol/L組與對照組無顯著差異外，其余各組細胞活力均明顯低于空白對照組( P＜0. 05)，且隨著ATP濃度增大，PC12細胞活力逐漸下降，見圖1。

2 NaHS對ATP誘導的PC12細胞活力的影響

不同濃度NaHS預孵育PC12細胞半小時后再用ATP( 3 mmol/L)處理。以空白對照組細胞活力為100%，ATP ( 3 mmol/L)組為83. 0%，50 μmol/L NaHS組為80. 0%，與ATP組相比無明顯差異; 200 μmol/L NaHS組為88. 4%，明顯高于ATP組( P＜0. 05) ; 800 μmol/L NaHS組為74. 2%，與ATP組相比反而下降( P＜0. 05)。由此表明濃度為200 μmol/ L的NaHS對ATP損傷的PC12細胞具有保護作用，但濃度為800 μmol/L的NaHS對細胞表現為損傷作用，見圖1。

3 ATP處理對PC12細胞［Ca2 +］i的影響

Figure 1.The effects of NaHS on the viability of PC12 cells injured by ATP.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATP group.圖1　NaHS對ATP致傷PC12細胞活力的影響

Figure 2.The effects of different concentrations of ATP on［Ca2 +］iof PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs control group.圖2　不同濃度ATP對PC12細胞［Ca2 +］i的影響

如圖2所示，加入1 mmol/L ATP后［Ca2 +］i輕微升高，與給藥前相比無明顯差異，但3 mmol/L ATP組［Ca2 +］i增加50%，顯著高于給藥前的基礎值( P＜0. 01)，5 mmol/L ATP組給藥后［Ca2 +］i增加66. 3%，也明顯高于給藥前( P＜0. 01)。結果提示一定濃度的ATP激活相應的嘌呤受體后，可使［Ca2 +］i明顯增加，Ca2 +或許是嘌呤信號分子在細胞內傳遞的關鍵分子。

4 KN-62與NaHS抑制ATP介導的［Ca2 +］i增高

分別給予P2X7受體阻斷劑KN-62與NaHS處理PC12細胞均未引起［Ca2 +］i增加，表明單獨使用KN-62或NaHS并不能改變PC12細胞［Ca2 +］i，即KN-62與NaHS均不能激活P2X7受體。

而P2X7受體阻斷劑KN-62預孵育0. 5 h后再加入ATP( 3 mmol/L)，KN-62 + ATP組［Ca2 +］i增幅為14. 5%，明顯低于ATP( 3 mmol/L)組的50%增幅( P＜0. 01)，表明ATP介導的［Ca2 +］i增高與P2X7受體的激活有關。NaHS預孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，NaHS + ATP組［Ca2 +］i增幅為21. 3%，也明顯低于ATP( 3 mmol/L)組的50% ( P＜0. 01)。表明NaHS有類似于KN-62下調ATP介導的［Ca2 +］i升高的作用。

若將NaHS和ATP同時加入，［Ca2 +］i增幅為42. 6%，與單純ATP( 3 mmol/L)處理組沒有顯著差異( P＞0. 05)。而NaHS預孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，［Ca2 +］i為21. 3%，明顯低于ATP( 3 mmol/L)組( P＜0. 01)。表明NaHS存在于反應體系的時間及與ATP加入的先后順序決定其作用的效果，0. 5 h的預處理能逆轉ATP介導的［Ca2 +］i升高，見圖3。

Figure 3.Inhibitory effects of KN-62 and NaHS on the increase in［Ca2 +］iinduced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs ATP group;##P＜0. 01 vs NaHS + ATP group.圖3　KN-62與NaHS抑制ATP介導的PC12細胞［Ca2 +］i的升高

5 ATP對PC12細胞膜孔形成的影響

不同濃度的ATP作用于PC12細胞1 h后，細胞對YO-PRO-1的攝取量隨ATP濃度的增加而增強，3 mmol/L ATP在分別作用15、30和60 min后，PC12細胞對YO-PRO-1的攝取隨時間的延長也明顯增強。表明ATP介導的PC12細胞膜孔形成既取決于ATP的濃度，又受到ATP作用時間長短的影響，見圖4。

Figure 4.The effect of ATP on the uptake of YO-PRO-1 in PC12 cells.Mean±SEM.n =3.＊＊P＜0. 01 vs 0 mmol/L;##P＜0. 01 vs 15 min.圖4　ATP對PC12細胞YO-PRO-1攝入的影響

6 KN-62與NaHS抑制ATP介導的細胞膜孔形成

分別用KN-62和NaHS預孵育0. 5 h再加入ATP( 3 mmol/L)，如圖5所示，NaHS + ATP組與KN-62 + ATP組對YO-PRO-1的攝取都明顯弱于單純ATP( 3 mmol/L)組( P＜0. 01)，表明NaHS和KN-62 對ATP介導的細胞膜孔形成都有抑制作用。

Figure 5.The effects of KN-62 and NaHS on YO-PRO-1 uptake induced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;##P＜0. 01 vs ATP group.圖5　KN-62和NaHS對胞外ATP誘導的PC12細胞攝入YO-PRO-1的影響

討論

PC12細胞是一種大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，在NGF誘導下其分化、生長、生理功能等方面均類似于神經元。用高濃度ATP處理PC12細胞，則類似于模擬體內各種病理條件如缺血、炎癥、休克時損傷神經元、膠質細胞釋放的大量ATP對病灶周圍正常神經元產生的損傷。本文的實驗表明0. 3 mmol/L ATP 對PC12細胞活力無影響，但隨ATP濃度的增加，PC12細胞的活力逐漸下降，傷亡的細胞也明顯增多，這些結果表明高濃度的ATP的確能造成神經元損傷并死亡。NaHS對ATP致傷PC12細胞的保護作用與其濃度有關，本實驗的結果顯示200 μmol/L濃度的保護作用較佳，更高濃度800 μmol/L的NaHS卻對ATP誘導的PC12細胞起損傷作用。有文獻指出過量的H2S是細胞色素氧化酶的強抑制劑，能與線粒體內膜呼吸鏈中的氧化型細胞色素氧化酶中的Fe3 +結合，抑制電子傳遞和氧的利用，引起細胞內缺氧，造成細胞內窒息［6］。孟金蘭等［7］也證實了在PC12細胞中，50～200 μmol/L NaHS可呈濃度依賴性促進存活素表達，而800 μmol/L NaHS處理后存活素的表達明顯低于對照組，與本實驗的結果相符合，都表明800 μmol/L NaHS對PC12細胞本身可能有損傷作用。

在真核細胞中，Ca2 +是一個非常重要的第二信使，參與調節細胞的各種生理生化反應過程［8］。在生理情況下，維持細胞內鈣穩態對健康細胞的生命活動是非常必要的，胞內Ca2 +的失調必將引起細胞損傷死亡。行妍妍等［9］提出了“鈣調整點”的假說，認為細胞內Ca2 +濃度過高或過低都會抑制細胞神經突起的生長，影響突觸傳遞、可塑性及神經元的發育。然而，神經系統功能發生紊亂(如腦缺血、低氧癥、低血糖癥、癲癇等)時，神經元將受到異常刺激，細胞內外的Ca2 +濃度發生波動［10］。腦卒中發生時，機體內的糖酵解增加，使乳酸和酮體聚積，pH值降低，引起細胞內鈣超載，胞漿內游離Ca2 +增多，線粒體膜電位降低，從而誘發神經細胞凋亡或壞死［11］。30年前Chahwala等［12］報道了細胞外的ATP能夠引起Ca2 +、Na+內流并使MEL細胞的活力下降。由此可見［Ca2 +］i增加會對細胞造成致命的損傷，維持［Ca2 +］i相對穩定對細胞的正常生存具有深遠的意義。

有研究表明體外活化P2X7受體需要細胞外ATP濃度≥1 mmol/L，而活化其它的P2受體需要ATP濃度＜100 μmol/L［13］，在我們實驗中1 mmol/L ATP對PC12細胞［Ca2 +］i影響甚小，3、5 mmol/L ATP使［Ca2 +］i顯著升高，看來ATP誘導PC12細胞［Ca2 +］i升高可能主要是通過激活細胞上的P2X7受體實現的。為證實這一觀點，我們進一步使用P2X7受體特異性的阻斷劑KN-62預處理，結果發現能對抗ATP引起的［Ca2 +］i升高，從而也印證了上述觀點。NaHS與ATP同時加入培養體系，ATP引起的PC12細胞［Ca2 +］i升高的現象沒有被抑制，而NaHS預孵育0. 5 h后再加入ATP，［Ca2 +］i升高卻明顯被逆轉，表明NaHS預孵育可以抑制P2X7受體的激活，為NaHS臨床使用的適宜時間提供了實驗依據。

通常P2X7受體作為陽離子通道發揮作用，但是經過反復或持續地暴露于高濃度的ATP時，可形成允許900 Da以下分子通透的“膜孔”［1］，膜孔的不斷增多導致細胞水腫，空泡形成、最終凋亡壞死。我們以分子量為629 Da的熒光物質YO-PRO-1攝入水平作為膜孔形成的指標，分別以不同濃度的ATP作用于PC12細胞，結果顯示隨ATP濃度的增高，細胞YO-PRO-1攝入水平也明顯增加。隨后我們用3 mmol/L ATP分別處理PC12細胞15 min、30 min、60 min，結果顯示隨ATP作用時間的延長，YO-PRO-1進入細胞也逐漸增多。以ATP作用15 min時PC12細胞內的熒光強度為100. 0%，30 min時熒光強度增至112. 2%，1 h時熒光強度達138. 0%。總之，同一作用時間，提高ATP濃度會加速PC12細胞膜孔的形成;而同一ATP濃度作用，則隨作用時間延長，也會促進膜孔的形成［14］。Auger等［15］在胸腺細胞中也證實了ATP持續地作用會促使膜孔形成，然后大分子的YO-PRO-1即進入細胞，而P2X7受體特異性的阻滯劑o-ATP能明顯拮抗這一現象。在我們的實驗中使用了另一種P2X7受體特異性阻滯劑KN-62，結果發現也能減少ATP引起的細胞對YO-PRO-1的攝取，為P2X7受體在ATP誘導的膜孔形成中的重要作用進一步提供了實驗依據。

細胞膜的通透性隨著ATP濃度改變發生了質的變化，結果細胞膜上形成了大“膜孔”，大量小于900 Da的有機物質自由進出，細胞內穩態失衡而死亡。H2S抗損傷保護細胞的作用已經在多個組織器官得到了證實［16］，H2S是否可通過調控膜孔的激活來實現抗損傷而保護細胞呢?本實驗用NaHS ( 200 μmol/L)預孵育30 min可顯著減少ATP誘導的YOPRO-1的攝取，減少PC12細胞對大分子的通透，減輕對PC12細胞的損傷，為NaHS調控膜孔激活觀點取得了初步證據。

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Protective effect of hydrogen sulfide on PC12 cells injured by ATP

MA Jie1，2，SHEN Hui1，3，WANG Lu1，SONG Jing-gui4，HAN Ya-zhou5，LI Dong-liang1
(1Department of Physiology and Neurobiology，2Affiliated Central Hospital，3The Third Affiliated Hospital，4The Second Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China;5Department of Neurology，Qinyang People’s Hospital，Qinyang 454550，China.E-mail: xyldl8@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To prove the purinergic signaling mechanism of the neuroprotective action of hydrogen sulfide by observing the effects of sodium hydrosulfide ( NaHS)，a donor of hydrogen sulfide，on the cell viability，intracellular Ca(2 +)concentration(［Ca(2 +)］i) and the change of membrane permeability in the PC12 cells injured by adenosine triphosphate ( ATP).METHODS: PC12 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into 4 groups.In control group，the cells were cultured without ATP treatment.In ATP group，the cells were treated with ATP after cultured for 24 h.In NaHS + ATP group，the cells were incubated with NaHS for 30 min before treated with ATP，and NaHS always existed in the reaction system.In KN-62 + ATP group，the cells were pretreated with KN-62 for 30 min，and the other treatments were as the same as those in NaHS + ATP group.The cell viability was assessed by MTT assay.The［Ca(2 +)］iwas detected by Fura-2/AM staining.The membrane permeability was observed by staining with fluorescent dye YO-PRO-1.RESULTS: ATP at concentration of 0.3 mmol/L showed no injury effect on the cells.However，the cell viability was dropped gradually in a dose-dependent manner as the ATP at doses of 1，3，5 and 10 mmol/L.The decline of cell viability by ATP was obviously reversed by 200 μmol/L of NaHS in the PC12 cells ( P＜0. 05)，but exasperated by 800 μmol/L of NaHS ( P＜0. 05).At the same time，ATP evoked the increase in［Ca(2 +)］iin a dose-dependent manner，which was inhibited by NaHS ( P＜0. 05).Furthermore，the YO-PRO-1 uptake induced by ATP in a dose-dependent and time-dependent manner was also reduced by NaHS ( P＜0. 05).CONCLUSION: Hydrogen sulfide has protective effect on the PC12 cells injured by ATP.The mechanism may be related to the reverse of the increased［Ca(2 +)］iand YO-PRO-1 uptake.

［KEY WORDS］Adenosine triphosphate; Hydrogen sulfide; Purinergic P2X7receptor; PC12 cells

通訊作者△Tel: 0373-3029104; E-mail: xyldl8@126.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目( No.81371346; No.81271376) ;新鄉醫學院2013年度研究生科研創新支持計劃資助項目( No.YJSCX201318Y)

［收稿日期］2014-10-22［修回日期］2015-03-02

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1231-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.014