PPARβ及NO在高糖高胰島素誘導心肌細胞肥大中的作用*

黃波，吳陽，薛萊，彭藝飛，邱紅梅，蔣青松

(重慶醫科大學藥理教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

PPARβ及NO在高糖高胰島素誘導心肌細胞肥大中的作用*

黃波，吳陽，薛萊，彭藝飛，邱紅梅，蔣青松△

(重慶醫科大學藥理教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

目的:觀察過氧化物酶體增殖物激活受體β(PPARβ)及一氧化氮(NO)相關信號通路在高糖高胰島素(HGI，25.5 mmol/L葡萄糖+0.1 μmol/L胰島素)誘導心肌肥大中的作用。方法:體外培養乳鼠心肌細胞，以細胞表面積、蛋白含量和心房鈉尿因子(ANF)mRNA表達作為心肌肥大的指標;利用real－time PCR、Western blotting、硝酸還原酶法和分光光度法分別檢測mRNA表達、蛋白表達、NO含量和NO合酶(NOS)活性。結果:HGI誘導心肌細胞出現肥大(P＜0.01)，PPARβ mRNA和蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，誘導型NOS(iNOS)mRNA和蛋白的表達則升高(P＜0.01)，NO含量和NOS活性增加(P＜0.01)。PPARβ激動劑GW0742能抑制HGI誘導的心肌肥大(P＜0.01)，上調PPARβ的表達，降低iNOS的表達，使NOS活性和NO含量恢復正常(P＜0.01)。PPARβ拮抗劑GSK0660可阻斷GW0742對心肌肥大的保護作用，取消其對PPARβ、iNOS mRNA和蛋白表達水平以及NOS活性和NO含量的作用(P＜0.05)。結論:PPARβ下調，激活iNOS－NO信號通路參與高糖高胰島素誘導心肌肥大過程。

過氧化物酶體增殖物激活受體β;誘導型一氧化氮合酶;一氧化氮;心肌肥大;高糖高胰島素

隨著生活水平的提高，糖尿病的發病率及相關死亡率越來越高;其并發癥，尤其心血管并發癥是糖尿病病人死亡的首要因素。流行病學調查顯示，糖尿病病人心血管疾病的發生率比無糖尿病的其他病人高2～5倍［1］。研究發現，在沒有高血壓和冠脈疾病存在的情況下，糖尿病本身即可引起心臟結構和功能的損傷，出現以心室肥厚、心室順應性降低和峰充盈率減少為主要特征的糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［2］。其中，心肌肥厚是DCM關鍵的結構改變，與糖尿病人心力衰竭、猝死等相關死亡的發生密切相關［3］，故對其病理生理機制的研究具有重要意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptors，PPARs)是配體激活的核轉錄因子，參與脂質代謝、胰島素敏感性、炎癥反應、細胞生長和增殖分化等重要生物調節過程［4－5］。PPARs的3種異構體(α、β和γ)具有不同的配體親和力和生物學效應。其中，PPARβ又稱為PPARδ或脂肪酸激活受體，廣泛表達于多種器官和組織，具有重要的生理調節作用［6］?，F有研究證實，在代謝綜合征相關疾病的治療中，PPARβ是一個重要的藥理學靶點［7］。但關于PPARβ在糖尿病心肌肥厚中的作用研究較少。另外，一氧化氮(nitric oxide，NO)已被證明除了參與壓力負荷型心肌肥厚的病理過程［8］，亦參與了糖尿病心肌肥厚的損傷過程［9］。作為多種信號通路的下游因子，PPARβ與NO的關系，尤其二者在糖尿病心肌肥厚中的作用，目前未見報道。

本研究擬利用高糖高胰島素(high glucose and insulin，HGI)模擬糖尿病時高糖血癥和高胰島素血癥環境，誘導乳鼠心肌細胞肥大［10］，對PPARβ及其與NO相關信號通路在糖尿病心肌肥大中的作用進行相關研究。

材料和方法

1 動物和主要試劑

清潔級，1～3日齡SD大鼠乳鼠由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2010－0001。

GW0742、GSK0660和5'－溴－2－脫氧尿嘧啶核苷(5'－bromo－2－deoxyuridine，5'－BrdU)均購自Sigma;胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑、DMSO、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天公司;DMEM和胎牛血清購自HyClone;NO含量測定試劑盒和總NO合酶(NO synthase，NOS)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Trizol購自大連寶生物公司;逆轉錄試劑盒和SYBR Green Supermix購自Bio－Rad;兔抗PPARβ多克隆抗體和兔抗iNOS多克隆抗體購自Cayman;PCR引物由Invitrogen公司負責合成和純化。其它試劑均為國產分析純。

2 主要方法

2.1 心肌細胞培養用胰蛋白酶消化法將乳鼠心室肌消化成單細胞懸液［10］，差速貼壁分離。將未貼壁心肌細胞用含20%胎牛血清的DMEM懸浮，調細胞密度分別接種于6孔板(1×108/L，檢測細胞表面積及總蛋白測定)或25 cm2培養瓶內(1×109/L，mRNA提取及檢測)，置于37℃、5%CO2培養箱中。18～30 h后見細胞貼壁生長，48 h出現自發搏動。培養初始48 h加入0.1 mmol/L 5'－BrdU抑制非心肌細胞生長。更換培養液繼續培養24 h，至72 h換無血清培養液并加入相應藥物，繼續孵育48 h后用于檢測。實驗共分為4組，即:(1)正常對照(control)組:葡萄糖(5.5 mmol/L)+甘露醇(20.0 mmol/L); (2)HGI組:葡萄糖(25.5 mmol/L)+胰島素(0.1 μmol/L);(3)HGI+GW0742(1 μmol/L)組;(4) HGI+GW0742(1 μmol/L)+GSK0660(1 μmol/ L)組。

2.2 心肌細胞表面積測量取長有心肌細胞的玻片，PBS清洗3次后，相差顯微鏡下觀察拍照，應用ImageJ 1.47v圖像分析系統測量單個細胞表面積。每張玻片取5個視野，每個視野檢測15～20個細胞，取平均值。每組重復3次。

2.3 心肌細胞總蛋白測定將6孔板內培養好的心肌細胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分攪動裂解5 min，轉移至EP管，超聲破碎3 min，存放于－80℃。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，檢測總蛋白含量。每組重復3次。

2.4 Real－time PCR法檢測心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor，ANF)、PPARβ和誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)mRNA的表達參照GenBank中大鼠的基因序列，各引物序列見表1。用Trizol提取心肌細胞總RNA，按說明書操作進行逆轉錄合成cDNA，利用SYBR Green熒光技術，在Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀按照如下反應條件進行擴增:95℃30 s;95℃5 s，60℃30 s，40個循環。以β－actin為內參照，Ct值為統計參數，相對定量法分析結果。每組重復3次。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.5 Western blotting法檢測PPARβ和iNOS蛋白的表達取30 μg總蛋白加入含β－巰基乙醇的上樣緩沖液，高溫煮沸10 min使蛋白變性，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜，BSA封閉1 h，加入不同I抗(均1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的II抗(1∶5 000稀釋)。洗膜后用發光液(Advanstor)顯色，凝膠成像儀與Image Lab軟件(Bio－Rad)照相顯影，分析結果。每組重復3次。

2.6 NOS活性檢測取培養上清液30 μL，按試劑盒說明書操作，在530 nm波長下測定吸光度(A值)。根據公式:總NOS活力(103U/L)=(總NOS活力測定管A－空白管A)×26.1/0.383×1.5，計算NOS活性。

2.7 NO含量檢測取培養上清液30 μL，硝酸還原酶法測定NO。按試劑盒說明書操作，在570 nm波長下測定A值。利用標準曲線，計算NO含量。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析，用Excel和GraphPad Prism 5.01等軟件作圖。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較使用單因素方差分析。

結果

1 HGI誘導心肌細胞肥大和GW0742的作用

HGI作用下，心肌細胞表面積、蛋白含量和ANF mRNA表達均明顯增加(P＜0.01)，提示心肌細胞肥大發生。若以平均值計算，HGI處理后，細胞表面積增加了3.5倍，蛋白含量增加了2.0倍，ANF的mRNA表達增加了3.8倍，見圖1、表2。

PPARβ特異性激動劑GW0742(1 μmol/L)明顯抑制HGI誘導的心肌細胞肥大(P＜0.05)，使HGI誘導增加的細胞表面積、蛋白含量和ANF的mRNA表達分別減少了54.6%、21.2%和31.3%。PPARβ阻斷劑GSK0660(1 μmol/L)完全阻斷了GW0742對HGI誘導心肌肥大的改善作用(P＜0.01)，各指標基本恢復至HGI模型組水平，見圖1、表2。

Figure1.Themorphologicalchangesofcardiomyocytes (×200).圖1 心肌細胞形態學檢測

表2 HGI誘導心肌肥大和GW0742的作用Table 2.The effects of GW0742 on the hypertrophic cardiomyocytes induced by HGI(Mean±SD.n=3)

2 HGI對心肌細胞PPARβ、iNOS mRNA和蛋白表達的影響及GW0742的作用

在HGI作用下，PPARβ的mRNA和蛋白表達分別降低了8.2%和45.2%(P＜0.05)。iNOS的mRNA表達則增加了4.3倍(P＜0.01)，蛋白表達亦增加了1.1倍(P＜0.01)。GW0742(1 μmol/L)顯著逆轉HGI導致的PPARβ mRNA和蛋白表達降低(P＜0.01)，使PPARβ表達增加;同時明顯降低HGI上調的iNOS mRNA和蛋白表達(P＜0.01)。GSK0660(1 μmol/L)完全取消了GW0742的作用(P＜0.01)，使PPARβ和iNOS的表達均接近于HGI誘導時的水平，見圖2、圖3。

Figure 2.Effects of GW0742 on the mRNA(A)and protein(B)expression of PPARβ in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖2 GW0742對HGI下調心肌細胞PPARβ mRNA和蛋白表達的作用

Figure 3.Effects of GW0742 on the mRNA(A)and protein(B)expressions of iNOS in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean ±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖3 GW0742對HGI誘導心肌細胞iNOS mRNA和蛋白表達的影響

3 HGI對心肌細胞NOS活性及NO含量的影響及GW0742的作用

HGI作用使NOS的活性和NO的含量分別增加了31%和65%(P＜0.01)。GW0742(1 μmol/L)明顯降低了NOS的活性和NO的含量(P＜0.01)，使其基本恢復至正常水平。GSK0660(1 μmol/L)完全取消了GW0742的作用(P＜0.01)，使NOS活性和NO含量均接近于HGI誘導時的水平。

Figure 4.Effects of GW0742 on the NOS activity(A)and NO concentration(B)in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖4 GW0742對HGI誘導心肌細胞NOS活性和NO含量的作用

討論

心肌肥厚是2型糖尿病患者常見的心血管并發癥，是DCM的重要特征之一，也是糖尿病病人心血管并發癥死亡常見的病理基礎，但其發病機制尚不清楚。現已證實，高血糖和高胰島素可作為獨立因素參與心肌肥厚的形成［11－12］。本實驗采用葡萄糖25.5 mmol/L和胰島素0.1 μmol/L模擬糖尿病時高糖高胰島素血癥環境，結果顯示心肌細胞表面積、總蛋白含量和心肌肥厚標志因子ANFmRNA的表達均明顯增加，提示糖尿病心肌細胞肥大模型建立成功。

近年研究發現，PPARs家族在代謝性疾病中具有重要的調節作用。PPARβ參與細胞的能量代謝、脂質調節和葡萄糖的利用，維持機體能量平衡。PPARβ可促進PPARγ輔激活因子－1α表達，從而增加脂肪酸β氧化，加強肌肉組織中線粒體呼吸鏈的活性，消耗能量，并改善胰島素敏感性［13］。在PPARβ基因敲除小鼠給予高脂飲食體重增加更明顯，而PPARβ轉基因小鼠則可減少肥胖發生和脂肪累積。另外，PPARβ可誘導高密度脂蛋白(high－density lipoprotein，HDL)生成，增加HDL水平［14］。PPARβ激動劑GW501516/GW1516、GW0742和L－165041均可增加高密度脂蛋白膽固醇，降低低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯，改善肥胖動物的血脂水平［15－16］。這些結果顯示，PPARβ參與了能量代謝和脂質調節，在糖尿病心肌肥厚中可能有重要作用。本研究結果顯示，在HGI誘導肥大的心肌細胞，PPARβ mRNA和蛋白表達明顯下降;PPARβ選擇性激動劑GW0742改善HGI作用同時，明顯上調PPARβ mRNA和蛋白的表達，提示糖尿病心肌肥大的發生與PPARβ表達的下調可能有直接關系。利用PPARβ選擇性阻斷劑GSK0660進一步研究顯示，GSK0660可完全阻斷GW0742對HGI誘導心肌細胞肥大的改善作用，PPARβ mRNA和蛋白的表達降至HGI模型組水平。該結果從另一個方面再次證實PPARβ相關信號通路在糖尿病心肌肥大病理生理發生發展中可能具有重要作用。

NO是心血管系統關鍵的信號分子之一［17］。大量研究顯示，在DCM中，NO與NOS參與了氧化應激、炎癥、高血壓、高膽固醇血癥等多種心血管疾病有關的病理過程［18］。正常情況下，心肌細胞通過內皮型NOS合成少量NO來維持生理功能。當受到內毒素、細胞因子等刺激后則表達iNOS，大量合成NO，參與病理過程。本實驗結果顯示，HGI誘導心肌肥大同時，iNOS在mRNA和蛋白水平的表達均明顯增加，總NOS活性亦增加，細胞培養上清液中NO含量明顯上升，提示iNOS－NO可能也參與了糖尿病心肌肥大的損傷過程。現有研究發現，PPARβ激活對腦梗塞大鼠的保護作用和對糖尿病內皮損傷的改善作用，都與其降低iNOS活性和NO含量有關［4，17］，提示NO可能是PPARβ的下游效應因子。本實驗中，給予PPARβ激動劑GW0742后，心肌肥大改善，PPARβ表達上調;同時，iNOS的表達、NOS活性及NO含量均恢復至正常水平;PPARβ阻斷劑GSK0660完全取消GW0742對心肌肥大的改善作用，下調PPARβ表達，同時亦阻斷GW0742對iNOS－NO通路的調控。這些結果提示，在糖尿病心肌肥大，可能存在PPARβ－iNOS－NO信號調控系統。

綜上所述，在高糖高胰島素環境下，PPARβ受體表達下調，iNOS－NO通路激活，最終導致心肌肥大。我們以前的研究證實，PPARα和PPARγ也參與了糖尿病心肌肥厚的病理過程［10，19］，提示PPARs家族在糖尿病心血管并發癥的發生發展中具有重要作用。但該過程是否還有其它信號通路參與，需要進行更多深入研究。

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Effects of PPARβ and NO on high glucose and insulin-induced cardiomyocyte hypertrophy

HUANG Bo，WU Yang，XUE Lai，PENG Yi－fei，QIU Hong－mei，JIANG Qing－song

(Department of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail:cqjiangqs@hotmail.com)

AIM:To investigate the role of peroxisome proliferator－activated receptor β(PPARβ)－nitric oxide (NO)signal pathway in cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose(25.5 mmol/L)and insulin(0.1 μmol/L) (HGI).METHODS:The cardiomyocyte hypertrophy was characterized in rat primary cardiomyocytes by measuring the cell surface area，protein content，and the mRNA expression of atrial natriuretic factor(ANF).The mRNA and protein expression were measured by real－time PCR and Western blotting，respectively.The activity of NO synthase(NOS)and NO content were measured by a reagent kit through ultraviolet spectroscopy.RESULTS:HGI induced profound change of hypertrophic morphology，and significantly increased the cell surface area，protein content and mRNA expression of ANF (P＜0.01)，but decreased the expression of PPARβ at mRNA and protein levels(P＜0.05).At the same time，the expression of inducible NOS(iNOS)was obviously elevated(P＜0.01)，which occurred in parallel with the rising NOS activity and NO concentration(P＜0.01).GW0742(1 μmol/L)，a selective PPARβ agonist，inhibited the cardiomyocyte hypertrophy induced by HGI(P＜0.01)，and up－regulated the expression of PPARβ at both mRNA and protein levels.Meanwhile，GW0742 also inhibited the increases in iNOS expression，NOS activity，and NO content induced by HGI，which were abolished by GSK0660(1 μmol/L)，a selective PPARβ antagonist(P＜0.01).CONCLUSION:PPARβ down－regulation and the following iNOS－NO activation are involved in the cardiomyocyte hypertrophy induced by HGI.

Peroxisome proliferator－activated receptor β;Inducible nitric oxide synthase;Nitric oxide;Myocardial hypertrophy;High glucose and insulin

R363;R587.1

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.013

1000－4718(2015)02－261－06

2014－09－19

2014－10－22

國家自然科學基金資助項目(No.81100905)

△通訊作者Tel:023－68485161;E－mail:cqjiangqs@hotmail.com