藥物性肝損傷與免疫性肝損傷肝組織中lncRNA表達譜的差異分析*

周軍，朱靈，曹海軍，李善高，呂賓

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科，浙江 杭州 310006)

藥物性肝損傷與免疫性肝損傷肝組織中lncRNA表達譜的差異分析*

周軍，朱靈，曹海軍，李善高△，呂賓

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科，浙江 杭州 310006)

目的:研究長鏈非編碼RNA(lncRNA)在藥物性肝損傷及免疫性肝損傷中表達譜的變化，并分析二者的差異。方法:利用lncRNA芯片技術分別檢測對乙酰氨基酚誘導的小鼠藥物性肝損傷及刀豆蛋白A誘導的小鼠免疫性肝損傷肝組織的lncRNA表達譜，通過對原始數據進行預處理達到均一化后，篩選出差異表達lncRNA并進行分析。結果:與正常肝臟組織比較，變化1.5倍以上并且差異有統計學意義(P＜0.05)的lncRNA被認為是差異表達的lncRNA;藥物性肝損傷肝組織中變化1.5倍以上的共68條，其中升高1.5倍以上的共21條，降低1.5倍以上的共47條;免疫性肝損傷肝組織中變化1.5倍以上的共60條，其中升高1.5倍以上的共17條，降低1.5倍以上的共43條。所有的lncRNA中有8條lncRNA同時在2種肝損傷肝組織中上調，在藥物性肝損傷肝組織上調的lncRNA中占38%，在免疫性肝損傷肝組織中占47%;有28條lncRNA同時在2種肝損傷肝組織中下調，在藥物性肝損傷肝組織下調的lncRNA中占59%，在免疫性肝損傷肝組織中占65%。結論:與正常肝臟組織比較，藥物性肝損傷肝組織和免疫性肝損傷肝組織中lncRNA表達譜均發生明顯變化，且2種不同肝損傷肝組織比較，lncRNA表達譜也存在差異，提示2種肝損傷肝組織中這些同時上、下調的lncRNA可能參與了2種肝損傷之間相似或是相同的病理生理過程，而那些表達不同的lncRNA可能參與相對特異的肝損傷機制的發生。

lncRNA;lncRNA芯片;藥物性肝損傷;免疫性肝損傷

藥物性肝損傷(drug－induced liver injury，DILI)和免疫性肝損傷(immune liver injury，ILI)是臨床上2種常見的肝損傷類型，是肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末期肝病發生及發展的重要病因，二者發病機制仍不十分清楚。長鏈非編碼RNA(long non－coding RNA，lncRNA)作為一種長度超過200 nt (核苷酸單位)的非編碼RNA，曾被認為是轉錄過程的副產物，不具有生物學功能［1］，但進一步的研究發現，它們能夠在多種水平調控基因的表達，廣泛參與機體幾乎所有的生理和病理過程［2］。本研究試圖采用對乙酰氨基酚及刀豆蛋白A分別復制的DILI及ILI動物模型，運用lncRNA芯片技術檢測2種肝損傷肝組織中lncRNA表達譜的變化并比較二者的差異，旨在為進一步研究lncRNA是否參與2種肝損傷發生機制的研究提供實驗依據。

材料和方法

1 動物和試劑

健康SPF級雄性BALB/c小鼠，體質量約(20± 2)g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心，普通飼料喂養，自由飲水進食。

對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)由日本梯希愛公司提供，臨用前用無菌生理鹽水配制成濃度為12.5 g/L溶液;刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)由Sigma提供，臨用前用無菌生理鹽水配成濃度為1 g/L溶液;AST和ALT采用全自動生化分析儀進行檢測。選用Mouse lncRNA表達陣列，芯片的選擇、探針設計、圖像采集和數據分析等由上海欣基生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 模型制備雄性BALB/c小鼠40只，體質量(20±2)g，同步飼養，適應1周后，隨機分為藥物組(DILI組)及對照組A(control A)、免疫組(ILI組)及對照組B(control B)，每組10只。DILI組按對乙酰氨基酚溶液0.04 mL/g一次性腹腔注射給藥，control A一次性腹腔注射相當量的無菌生理鹽水。ILI組按刀豆蛋白A溶液0.02 mL/g一次性尾靜脈注射給藥，control B一次性尾靜脈注射相當量的無菌生理鹽水。

2.2 樣本采集于DILI組及control A給藥24 h后、ILI組及control B給藥12 h后分別行小鼠眼球取血，分離血清用于AST和ALT檢測;處死后取新鮮肝組織于－80℃保存用于lncRNA檢測，另取肝組織浸泡于10%甲醛中，用于組織病理學檢查。

2.3 血清ALT和AST活性的檢測采用全自動生化分析儀測定各組動物血清ALT和AST水平。

2.4 肝臟組織的病理學檢查取浸泡于10%甲醛中肝臟組織，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學變化。

2.5 芯片選擇和探針設計利用Affymetrix公司的GeneChip Mouse Gene 2.0 Array，覆蓋目前RefSeq、Ensemble、FANTOM3和lncRNAdb等多個數據庫的lncRNA。Affymetrix lncRNA芯片設計探針采用25 mer的寡核苷酸。用于芯片雜交中質量評估的外標基因包括BioB、BioC、BioD和Cre，由Affymetrix提供，作為雜交過程的對照。

2.6 樣本總RNA的提取與檢測按照Trizol說明書，分別提取對照組肝組織和2種肝損傷肝組織的總RNA。紫外分光光度計測定吸光度值A260和A280，對總RNA進行定量;并計算A260/A280值，結合甲醛變性凝膠電泳，分析RNA質量。

2.7 芯片實驗利用Invitrogen提供的ds－cDNA合成試劑盒，完成cDNA的合成，利用GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit試劑盒進行完成cDNA樣品標記和雜交。利用GeneChip Scanner 3000 7G掃描儀掃描芯片的熒光強度，然后將掃描圖像輸入Affymetrix GeneChip Operating Software以進行網格對齊與表達數據分析，采用Affymetrix Expression Console進行數據解析。

2.8 Real－time PCR驗證挑選變化倍數最大的lncRNA進行real－time PCR驗證，分別以來自藥物組、免疫組及相應對照組cDNA分子為模板，采用Bio－Rad熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料(TaRa－Ka)摻入法相對定量。以GAPDH為內參照，計算差異表達的倍數。

3 統計學處理

利用SPSS 17.0軟件分析處理數據，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 血清AST與ALT的檢測結果

小鼠注射對乙酰氨基酚24 h及注射刀豆蛋白A 12 h后，肝臟均受到損傷，DILI組及ILI組的血清ALT和AST活性較相對應空白組均明顯增高，且差異顯著(P＜0.01);control A、B組之間比較ALT和AST活性無明顯差異，見表1。

表1 DILI和ILI小鼠血清ALT和AST活性的變化Table 1.Changes of serum alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activitiy in DILI mice and ILI mice(U/L.Mean±SD.n=10)

2 組織病理學的改變

肉眼可見DILI組及ILI組肝臟充血、淤血明顯。鏡下觀:DILI組肝細胞腫脹、壞死，以實質細胞點狀及局灶性壞死明顯，肝細胞核崩解，染色質凝集，肝小葉結構不清，有廣泛炎癥細胞浸潤，肝血竇消失，肝竇狀隙和中央靜脈淤血、出血;ILI組肝細胞腫脹、細胞漿疏松化，有的呈氣球樣變，可見點狀壞死和灶性壞死，并伴大量炎性細胞浸潤，以匯管區為明顯，肝竇內可見紅細胞瘀積。所對應的control A組及control B組小鼠肝臟均未見以上改變。

3 總RNA樣本質量分析

每份樣品總RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間，總量都在30 μg到80 μg之間。總RNA經瓊脂糖凝膠電泳，可見到18S和28S兩條亮而濃的條帶，并且28S的密度大約是18S的2倍。下方有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA (tRNA和5S核糖體RNA等)組成，在28S和18S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。結果證實獲得較高純度的總RNA。

4 芯片雜交質量的評估

對雜交后小鼠基因芯片的掃描分析顯示，芯片的四角點陣和芯片的陣列名標志清晰，芯片中間的“+”符號也清晰可見;從芯片雜交分析的質控數據可見，各組芯片的信號值高于背景值，表示信號值與背景值正常;外加的陽性對照BioB、BioC、BioD和Cre均能檢測到，且信號值(3’/5’)均小于3。以上說明各組芯片雜交和檢測的質量較高，結果可靠。

5 芯片雜交結果

對照組小鼠肝組織及肝損傷肝組織芯片雜交后的微點陣圖片表明:DILI組與對照組比較，變化1.5倍以上并且差異有統計學意義(P＜0.05)的lncRNA共68條，其中升高1.5倍以上的共21條，降低1.5倍以上的共47條(表2);ILI組與對照組比較，變化1.5倍以上并且差異有統計學意義(P＜0.05)的lncRNA共60條，其中升高1.5倍以上的共17條，降低1.5倍以上的共43條(表3)。有8條lncRNA同時在2種肝損傷肝組織中上調，在DILI肝組織上調的lncRNA中占38%，在ILI肝組織中占47%(表4);有28條lncRNA同時在2種肝損傷肝組織中下調，在DILI肝組織下調的lncRNA中占59%，在ILI肝組織中占65%(表5)。2對照組之間并未發現有變化1.5倍以上并且差異有統計學意義(P＜0.05)的lncRNA。

表2 DILI肝組織中差異表達的lncRNATable 2.The differentially expressed lncRNA(fold change＞1.5)in DILI group

Table 2.(continued)

表3 ILI肝組織中差異表達的lncRNATable 3.The differentially expressed lncRNA(fold change＞1.5)in ILI group

Table 3.(continued)

表4 藥物性肝損傷肝組織及免疫性肝損傷肝組織中同時上調的lncRNATable 4.The simultaneously up－regulated lncRNA in DILI and ILI groups

表5 藥物性肝損傷肝組織及免疫性肝損傷肝組織中同時下調的lncRNATable 5.The simultaneously down－regulated lncRNA in DILI and ILI groups

6 Real-time PCR結果

采用real－time PCR進一步測定2種肝損傷小鼠肝組織中同時存在且顯著差異的4種lncRNA (A130040M12Rik、LOC100862007、C730036E19Rik和Gm19894)的表達情況。與對照組的肝組織相比，A130040M12Rik和LOC100861856表達上調，C730036E19Rik和Gm19894表達下調，見圖1，與芯片檢測結果一致。

討論

現已有的研究表明lncRNA廣泛參與多種肝臟疾病的發生、發展及預后過程。如HULC在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者肝癌組織及血液標本中均高表達，進一步研究發現HULC可以下調miRNA－372，并抑制其靶基因的表達［3－4］。HOTAIR可以促進HCC細胞生長及侵襲能力，敲除HOTAIR可促進TNF－α介導的細胞凋亡及增加癌細胞對順鉑、多柔比星的化療敏感性［5］。MEG3可顯著抑制HCC細胞生長并誘導細胞凋亡［6］。H19可以抑制HCC的轉移，并且抑制上皮－間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)關鍵分子的表達［7］。lncRNA－LALR(an lncRNA associated with liver regeneration)可以通過激活Wnt/β信號通路來抑制AXIN1，從而促進細胞周期蛋白D1的表達，通過促進細胞周期過程增強肝細胞的再生，為肝衰竭及肝移植方面研究提供新的思路［8］。在有馬洛里小體形成的酒精性肝病及非酒精性肝病的小鼠肝細胞中，可發現H19表達上調，MEG3表達下調，喂養S－腺苷甲硫胺酸能夠阻止上述lncRNA的改變［9］。以上表明lncRNA在肝臟多種疾病的發生及發展中均發揮著重要的作用，但目前這些我們已鑒定功能的lncRNA僅僅是依據生物信息學手段所推測數目的冰山一角［10］，而在DILI和ILI發生過程中lncRNA表達譜是否發生變化，lncRNA是否也發揮重要作用，目前國內外尚無文獻報道。

DILI和ILI在臨床上十分常見，且由于臨床表現類似、自身抗體特異性差及用藥和肝損傷之間的因果關系判斷困難，有時難以鑒別。2種肝損傷發病機制均較復雜，目前并未完全明確。現有研究表明兩者之間也存在許多相同或相似的發病機制，如藥物或其代謝產物的致敏過程，炎癥因子如腫瘤壞死因子、白細胞介素參與的炎癥反應，細胞結構的破壞，胞膜通透性的改變，肝組織過氧化損傷，肝細胞的凋亡或壞死等過程［11－13］。因此通過對DILI及ILI肝組織中lncRNA表達譜差異的分析可望有助于更進一步揭示2種肝損傷的發病機制以及為兩者的鑒別提供可能的線索。

Figure 1.Differentially expressed lncRNA identified by real－time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control A;##P＜0.01 vs control B.圖1 Real-time PCR檢測肝組織差異表達的lncRNA

本研究分別選用對乙酰氨基酚腹腔注射和刀豆蛋白A尾靜脈注射成功復制了藥物性肝損傷及免疫性肝損傷動物模型，通過lncRNA芯片技術對2種肝損傷動物模型的肝組織中lncRNA表達譜分析，研究表明在2種肝損傷中同時上調的lncRNA有8條，同時下調的有28條，這些共lncRNA可能同時參與以上2種肝損傷共同的病理生理過程，但也不排除在其它的肝損傷，如酒精性肝病、脂肪性肝病或肝硬化中存在類似的差異表達，若進一步實驗能證實，則可推斷這些lncRNA可能固定參與肝組織的損傷。除共同上、下調的lncRNA外，在DILI中尚有13條上調lncRNA和19條下調lncRNA相對于ILI較特異，而ILI中有9條上調的lncRNA和15條下調的lncRNA相對于DILI特異，進一步針對性研究這些相對差異的lncRNA與某一種肝損傷之間的關系可能為揭示該類lncRNA在相應肝損傷中的作用分子機制提供實驗依據。

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Differential expression profile of long non-coding RNA in hepatic tissue between drug-induced liver injury and immune liver injury

ZHOU Jun，ZHU Ling，CAO Hai－jun，LI Shan－gao，Lü Bin

(Department of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China.E-mail:galisga@aliyun.com)

AIM:To analyze the expression profile of long non－coding RNA(lncRNA)in the liver tissues of drug－induced liver injury(DILI)and immune liver injury(ILI).METHODS:The technique of lncRNA microarray was used to inspect the lncRNA expression profile in the mouse liver tissues that the liver injury was induced by acetaminophen or concanavalin A.The raw data of lncRNA were pretreated for normalization.RESULTS:Compared with normal hepatic tissue，the lncRNA which had more than 1.5－fold variation and significant difference(P＜0.05)by statistical analysis were regarded as lncRNA with differential expression.A total of 68 lncRNA with differential expression were found in the hepatic tissues of DILI，with 21 increased more than 1.5 folds and 47 reduced more than 1.5 folds.A total of 60 lncRNA with differential expression in the liver tissues of ILI were observed，with 17 increased more than 1.5 folds and 43 reduced more than 1.5 folds.In all lncRNA，8 was simultaneously up－regulated in 2 liver injury models，accounting for 38%and 47%respectively，while 28 was simultaneously down－regulated in 2 liver injury models，accounting for 59%and 65%respectively.CONCLUSION:lncRNA expression profiles of DILI and ILI change significantly in comparison with normal hepatic tissue，and there are also differences between 2 hepatic damage models.The simultaneous changes of lncRNA may participate in the same or similar pathophysiological process，while the differences may be involved in relatively particular mechanisms.

lncRNA;lncRNA microarray;Drug－induced liver injury;Immune liver injury

R393

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.022

1000－4718(2015)02－313－06

2014－08－20

2014－11－14

浙江省自然科學基金資助項目(No.LY14H030007)

△通訊作者Tel:0571－86919331;E－mail:galisga@aliyun.com