雙色雙融合及雙色分離探針檢測成人急性淋巴細胞白血病BCR－ABL 融合基因及11q23/MLL 基因重排

梁 亮，王 巍，李慶華，文瑞婷，蔡靜怡，張宇明，楊志剛 (廣東醫學院附屬醫院血液科，廣東 湛江 524001)

間期熒光原位雜交技術(iFISH)的雙色雙融合探針和雙色分離探針因其簡便、精確性、穩定性高等特點，近年來被廣泛應用于識別惡性血液病的變異基因及異常核型［1－2］。BCR－ABL 融合基因和混合譜系白血病基因(MLL)與白血病分型、治療及預后密切相關，已成為急性淋巴細胞白血病(ALL)診斷的常規檢測項目。2010 ～2013 年間筆者應用雙色雙融合BCR－ABL 探針、雙色分離11q23/MLL 探針對105 例初診成人ALL 患者進行了檢測，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:觀察組:選擇2010 年1 月～2013 年9 月我院收治的初診成人ALL 患者105 例，其中男68 例，女37 例，年齡最小14 歲，最大85 歲。對照組:同期10 例確診為缺鐵性貧血患者，其中男3 例，女7 例，年齡16 ～78 歲，中位年齡38.7歲，骨髓細胞形態學檢查為增生性貧血骨髓象。

1.2 試劑與探針:試劑:0.075 mol/LKCl，3∶1 甲醇/冰醋酸固定液，2×SSC 溶液，70%、85%、100%乙醇，0.3%NP－40/0.4×SSC，0.1NP－40/2×SSC，4，6－二脒基－2 苯基吲哚(DAPI)Ⅱ，雜交緩沖液。FISH 探針:BCR－ABL 探針選用雙色雙融合探針，MLL 探針選用雙色分離探針(均為英國Cyctocell 公司產品)。其中BCR 探針長約112 Mb，為光譜綠色標記，ABL探針長約650 kb，為光譜橘紅色標記。MLL 探針長約255 kb，22q11.2 為光譜橘紅色標記，9q34 為光譜綠色標記。

1.3 iFISH 檢測步驟:取治療前骨髓標本1.0 ～2.0 ml 加秋水仙素制備染色體標本，參考探針試劑說明書進行制片、探針準備、加入探針、變性、雜交、洗滌、復染等步驟，最后將雜交玻片置于型熒光顯微鏡下，選用DAPI/FITC/Rhodamine 濾光片組下觀察檢測。MLL 基因重排正常信號顯示2 個融合的黃色信號，典型異常信號為1 紅1 綠1 黃或2 紅2 綠;BCR－ABL 融合基因正常信號顯示2 紅2 綠，典型異常信號為1 紅1 綠2 黃的融合信號。每例至少分析200 個細胞，用FISH 軟件采集圖像。

1.4 iFISH 閾值界定:每份樣本分析200 個細胞，計算出顯示異常信號的細胞數、百分比的平均值及標準差，閾值定義為平均值+3 倍標準差，即閾值=平均值+3×標準差。本研究將陽性細胞率＞5.0%定義為MLL 基因重排和BCR－ABL 融合基因陽性。

1.5 染色體核型分析:骨髓細胞染色體制備采用短期培養法，采用R 顯帶技術，按國際細胞遺傳學命名標準(ISCN2009)進行核型分析，每例核型分析數至少20 個分裂相。

2 結果

2.1 臨床特征:所有患者都進行了FISH 檢測BCR－ABL 融合基因及MLL 基因重排，其中BCR/ABL 融合基因陽性患者20 例，占19.0%(20/105)，男性女性患者各10 例，平均年齡43.2 歲。白細胞總數＞100×109/L 6 例(30%)，30 ～100×109/L 8 例(40%)，＜10×109/L 2 例(10%)，外周血白細胞中位數為105.4×109/L。經FAB 及免疫分型確診B－ALL 16 例，B/My－ALL 4 例。MLL基因重排陽性患者5 例，占4.8%(5/105)，均為男性，平均年齡28.2 歲，外周血白細胞中位數為180.2×109/L。經FAB 及免疫分型確診B－ALL 4 例，B/My－ALL 1 例。

2.2 iFISH 檢測結果:BCR－ABL 融合基因陽性熒光信號為50%～98%，MLL 基因重排陽性熒光信號為64 ～95%(iFISH檢測結果，見圖1 ～4)。

圖1 陽性圖像

圖2 陰性圖像

圖3 陽性圖像

圖4 陰性圖像

2.3 染色體核型分析結果:BCR－ABL 融合基因陽性和MLL基因重排陽性患者中有23 例進行染色體核型分析，結果如下:無分裂相6 例(26.1%)，正常核型7 例(30.4%)，單純t(9;22)核型2 例，Ph+伴附加染色體異常3 例;11q23/MLL 基因重排染色體核型3 例;其他異常核型2 例。

2.4 療效:25 例患者中有16 例接受了誘導緩解化療，9 例放棄治療。BCR－ABL 融合基因陽性患者首次誘導化療完全緩解率為50%(6/12)，2 例誘導緩解未達CR 的患者予伊馬替尼單藥治療，1 例在1 個月后死亡，1 例3 個月后獲完全緩解，緩解6 個月后復發死亡，生存期為12 個月;僅有2 例患者聯合伊馬替尼治療取得血液學及分子遺傳學完全緩解，其中1 例行Auto－PBSCT 后繼續予伊馬替尼維持治療，生存期分別為6個月、16 個月。4 例MLL 基因重排陽性患者首次誘導化療后均獲得完全緩解，但3 例在緩解后2 ～12 個月復發死亡。

3 討論

目前常用于檢測白血病融合基因的方法主要有常規染色體核型分析、RT－PCR 技術及熒光原位雜交技術等。iFISH技術可檢測特異性的染色體異常，且不受分裂相限制，可分析大量間期細胞(通常觀察200 ～400 個細胞)，其靈敏度較高、精確性較好，可彌補傳統染色體顯帶技術的不足。本研究23 例BCR－ABL 融合基因及MLL 重排基因陽性患者核型結果中僅檢測出Ph 染色體5 例，11q23 基因重排染色體3 例，檢出率僅有34.8%(8/23)。而無分裂相6 例，核型正常、未檢測到異常7 例，其他異常核型2 例，該部分病例應用iFISH 技術檢測BCR－ABL 融合基因陽性13 例(BCR－ABL 陽性信號50%～98%)，MLL 重排基因陽性2 例(MLL 基因重排陽性信號56%～95%)。由此可見，iFISH 技術的失敗率較低，穩定性較高，應用iFISH 技術能確定常規染色體顯帶技術未能發現的隱匿性核型，提高Ph 染色體及11q23 基因重排染色體的檢出率。

進一步追蹤分析疾病緩解狀態發現，1 例患者首療程化療達骨髓完全緩解時iFISH 復查MLL 基因重排陽性細胞比例為12%，2 個月后即出現復發，MLL 基因重排陽性細胞比例再次增高為80%，而首療程取得血液學及分子遺傳學緩解患者，其持續緩解期為12 個月。治療后同時復查骨髓細胞形態學檢查及BCR/ABL 融合基因患者有4 例，其中2 例經伊馬替尼聯合化療后達血液學及分子遺傳學完全緩解，而僅達到血液學完全緩解1 例患者(FISH 檢測BCR/ABL 融合基因陽性信號仍有57%)選擇伊馬替尼單藥治療，經伊馬替尼單藥治療3 個月后復查骨髓雖然達到完全緩解，iFISH 檢測BCR－ABL 融合基因陽性信號5%，9 個月后iFISH 檢測BCR/ABL 融合基因陽性信號96%，骨髓提示復發。從上述動態iFISH 檢測數據可以看到，iFISH 技術不僅較常規染色體顯帶技術更為靈敏，還可對治療過程中白血病陽性克隆細胞進行定量分析，較好地評估白血病微小殘留病灶及緩解質量，有助于確定臨床治療方案。

綜上所述，應用雙色雙融合及雙色分離iFISH 探針可以有效地檢測出BCR－ABL 融合基因和MLL 基因重排，對ALL危險度分層、個體化治療及預后評估具有重要的臨床指導意義。

［1］ Primo D，T abernero MD，Ras illo A，et al.Patterns of BCR/ABL gene rearrangements by interphase fluorescence in situ hybridization( FISH) in BCR/ABL + leukemias:incidence and underlying Genetic abnormalities［J］.Leukemia，2003，17(6):1124.

［2］ 郭 搏，達萬明，韓曉萍等.雙色雙融合熒光原位雜交檢測成人急性淋巴細胞白血病BCR－AB L 基因重排［J］.中華檢驗醫學雜志，2006，29(10) :902.