組蛋白去乙酰化酶抑制劑對重度失血性休克大鼠生存情況的影響

鄧高榮，吳炳華，高翔，董玉瑩，繆鋅，黃巍，凌強，李宗芳

(1南昌大學第四附屬醫院，南昌330003;2西安交通大學第二附屬醫院)

失血性休克是由各種致傷因素創傷后急性失血引起，嚴重危及患者生命健康，是外科急救領域亟需解決的問題。除了傳統的液體復蘇外，研究結果表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACIs)可抑制組織細胞程序性及非程序性死亡，故能減輕休克引起的重要器官功能損傷［1，2］，并顯著改善失血性動物生存狀況［3］，但國內未見相關研究報道。我們于2012～2013年選取軟木酰苯胺氧肟酸(SAHA)和丙戊酸(VPA)兩個常用HDACIs治療重度失血性休克大鼠，觀察其對大鼠生存時間與12 h內生存率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF清潔級健康成年SD雄性大鼠63只，體質量317～405 g，由南昌大學動物實驗科學部提供。置于安靜、恒溫(20℃)、避光環境下適應性飼養3 d。微量注射泵(貝朗醫療，德國)、顯微外科器械(江蘇視卓醫療器械有限公司)、泰盟BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟軟件有限公司)、NOVA血氣分析儀(NOVA，美國)，血清乳酸試劑盒(南京建成生物)、戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、UV2450紫外可見光分光光度計(島津，日本)和PE50導管(上海必鼎它生物)等。藥物配制:使用前先將SAHA(Selleck，USA)溶解于DMSO做成母液，再將母液溶解于生理鹽水中配置成濃度為5 mg/mL的溶液;VPA(Sigma-Aldrich，美國)溶解于生理鹽水中配置成濃度30 mg/mL的溶液，經孔徑0.22 μm針式過濾器過濾除菌。

1.2 動物分組及模型制備 所有大鼠實驗前6 h禁食，可正常飲水、自由活動;動物稱質量后用2%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。右側腹股溝及背部剪毛備皮、碘伏消毒，將PE50導管從背部皮下引至側腹股溝皮下。腹部斜行切口內顯微技術分離股動靜脈，分別將PE50導管置入并固定于股動靜脈中，檢測導管通暢取2%肝素封管。將大鼠放置試驗臺等待麻醉清醒。采用股動靜脈導管分時放血法建立總失血量占總血量60%的重度休克大鼠模型。大鼠總血量計算公式［2］為:總血量(mL)=0.06×體質量(g)+0.77。采用三段分時失血建模:第1個10 min內快速動脈失血達總失血量的50%，第2個10 min動脈失血達總失血的30%，第3個10 min內靜脈失血達總失血量的20%，最后控制模型平均動脈壓(MAP)為(45±5)mmHg者有效。成功建模48只，按照隨機原則將模型大鼠分成三組，即SAHA組、VPA組和對照組各16只。

1.3 動物處理 建模成功后，按照大鼠體質量計算SAHA(8 mg/kg)和VPA(30 mg/kg)劑量再稀釋成1 mL，經微量泵靜脈10 min泵入;VPA 1 mL腹部皮下注射;對照組等量生理鹽水靜脈推注。

最后通過貫徹和落實基層網絡黨建工作形式，實現黨建工作常態化的有效運轉，為此高校基層黨建部門要將網絡改革放在工作模式創新的首要位置，建立其全面的、科學的、專業的黨建網絡工作平臺。大學生可以通過瀏覽黨建網站平臺的各種信息資源，加深學生對黨建部門的認知和了解，使其能夠積極主動的參與黨建部門開展的各種文化活動，在潛移默化中提高學生的思想政治素養[5]。此外高校基層黨建工作還可以通過網絡平臺加強和學生的溝通交流，能夠及時發現和了解學生反饋的各種問題，幫助學生解決日常生活和學習中遇到的各種問題，推進基層黨建工作的積極開展。

動物建模的研究中發現，大鼠處于休克狀態后血壓具有很強的自我恢復調節能力，這種調節與休克程度密切相關。故在雙階段放血方式與梯度放血［4～6］的基礎上，我們改進為三段分時失血建模，擬模仿外傷失血的過程，該法與實際情況更相符。我們認為失血速度約為3.2 mL/10 min為理想的失血速度。其中，還應該充分估計隱性失血，包括切口、皮下隧道及背部切口的失血。在股動靜脈顯露、分離及置管中盡可能采用顯微外科技術，這樣能夠提高造模的成功率，本實驗中造模成功率為76.19%(48/63)。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

由于腫瘤等疾病的發生與表觀遺傳學關系密切，表觀遺傳修飾中組蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)之間的動態平衡控制著染色質結構和基因表達，進而干擾疾病的發展進程。隨著對HAT/HDACs研究的深入，失血性休克能誘導HAT/HDACs的比例不平衡，進一步影響細胞組蛋白或非組蛋白的乙酰化狀態，HDACIs可以通過修正這種不平衡來改善組織器官的功能，故對各組織器官具有保護作用［7，8］。Zacharias等［9］還提出該機制涉及磷脂酰肌醇-3-羥基激酶及下游的蛋白激酶B，最后通過Bcl-2作為抗凋亡因子提高失血性休克動物的生存率。Gonzales等［10］使用 VPA和2-methyl-2-pentenoic acid(2M2P)治療失血40%大鼠休克模型，12 h后與對照組相比，VPA治療組70%和2M2P治療組12%大鼠存活，而對照組無一存活。VPA治療組12 h生存率遠高于本實驗的SAHA組(31.25%)和VPA組(12.50%)，主要因為本組模型為失血60%的重度休克。Hwabejire等［11］比較不同劑量VPA(300、400、450 mg/kg)治療失血40%的大鼠休克模型，發現不同劑量VPA對大鼠生存影響不明顯。Dekker等［12］采用 VPA+新鮮冰凍血漿(FFP)治療豬失血性休克復合大腦損傷的模型，實驗結果表明，其比單用FFP更明顯提高大腦血小板活化水平，最終增強治療效果。隨著工業化社會發展，失血性休克發病率正在逐年上升。因此，尋求在傳統液體復蘇、輸血及對癥處理之外的抗休克治療顯得尤其重要，HDACIs對失血性休克器官保護作用研究符合這一創新觀念［13］。

表1 三組體質量、建模前MAP、手術時間、總失血量及血乳酸水平比較(±s)

表1 三組體質量、建模前MAP、手術時間、總失血量及血乳酸水平比較(±s)

組別 n 體質量(g) 建模前MAP(mmHg) 手術時間(min) 總失血量(mL) 血乳酸(mmol/L)對照組 16 356.6±20.05 113.63±3.44 22.7±1.17 13.3±0.72 7.06±0.83 SAHA組 16 355.8±21.15 112.26±3.46 22.7±1.01 13.3±0.77 7.46±0.88 VPA組 16 349.4±19.61 112.36±3.39 23.4±3.11 13.0±0.71 7.53±0.74

綜上所述，在當今的新媒體時代，對于報刊行業而言，提高報社記者新聞采編能力是尤為重要的，也是刻不容緩的。只有不斷的提升報刊記者的新聞采編能力，才能夠有效的提升報刊新聞的質量，以此來逐步的提升報刊行業在當前新聞傳播領域的競爭力度，使其能夠可持續性的發展下去。

2.2 各組生存時間和12 h內生存率比較 對照組生存時間(7.04±0.97)h、12 h內生存率0，SAHA組分別為(11.86 ±2.35)、31.25%(5/16)，VPA 組分別為(10.56±1.56)h、12.50%(2/16)。SAHA組、VPA組生存時間、12 h內生存率均高于對照組(P均＜0.05)，且SAHA組生存時間、12 h內生存率高于VPA組(P均＜0.05)。

3 討論

1.4 觀察指標及方法 血乳酸測定按血清乳酸試劑盒操作;股動脈采血檢測血氣分析(RAPIDLab348血氣分析系統，德國)，采大鼠股動脈血0.5 mL滴入檢測試劑片中，收集其pH、PaO2、PaCO2等生理指標對模型進行驗證。經驗證建模成功后按上述劑量與方式將相應藥物注射后徹底堵管，注射青霉素抗感染。大鼠放置保溫環境下自由活動，禁食禁水，待昏迷后用BL-420F生物機能實驗系統連接大鼠肢體導聯的心電監護。此外，建模過程中還應該注意無菌操作，大鼠正確的保溫、固定及抗感染等。

2.1 各組體質量、建模前MAP、手術時間、總失血量及血乳酸水平比較 本實驗重度失血性休克大鼠建模成功率為76.19%(48/63)。各組間體質量、建模前MAP、手術時間、總失血量及血乳酸水平比較差異均無統計學意義(P均＞0.05)。見表1。

本研究中，SAHA組休克大鼠生存時間、24 h生存率明顯優于VPA組，表明HDACIs能夠明顯延長重度失血性休克大鼠的生存時間，而且SAHA對失血性大鼠的生存保護作用優于VPA。本研究與其他研究結果說明，失血性休克通過誘導 HAT/HDACs的比例失衡，進而影響細胞組蛋白或非組蛋白的乙酰化狀態。我們推斷，組蛋白乙酰化狀態將與休克轉歸和次發的主要器官修復存在關聯。HDACIs抗休克作用機制主要通過組織器官細胞凋亡實現的，HDACIs能導致Bcl-2在組織中高表達是最為有力的證據［9］，今后繼續進行其他凋亡相關基因表達的實驗觀察和討論;另一方面，組蛋白乙酰化狀態也決定了染色質分子核小體空間狀態的變化，其C-端疏水氨基酸位于核小體的內部，N-端的賴氨酸殘基延伸出核小體外;組蛋白乙酰化酶乙酰化還能促進或防止與其他轉錄或調節相關蛋白的相互作用;組蛋白乙酰轉移酶復合物參與轉錄激活、基因沉默、細胞周期調控、DNA復制、修復以及染色體組裝等許多重要的生理過程［14］。因此，HDACIs有助于染色質分子呈舒展張開狀態，能夠加快休克修復應急蛋白的翻譯合成，實現快速休克修復，這些機制皆值得進一步研究。

石門桂花村是石門鎮著名的旅游景點之一，在石門旅游中扮演著重要的角色。但是，石門桂花村還存在著知名度不高、游客接待量少、基礎設施不完善、經營管理不到位等方面的問題，對石門桂花村的旅游發展造成了阻力。為了解決石門桂花村現存的問題，可以從提升管理部門水平，推出特色旅游項目，完善基礎設施，加強經營管理等方面入手，加快對石門桂花村的旅游發展進程。

1)頂板錨索規格為直徑22 mm的1×19股高強度低松弛鋼絞線，破斷載荷580 kN，延伸率不低于7%，長度5.3 m，間排距為1 100 mm×1 000 mm；構件為高強度拱形托板，規格300 mm×300 mm×16 mm，初始張拉力不低于300 kN。

總之，兩種HDACIs均能明顯延長重度失血性休克大鼠的生存時間，提高12 h生存率;而且SAHA對失血性大鼠的生存保護作用優于VPA。

［1］Gonzales ER，Chen H，Munuve RM，et al.Hepatoprotection and lethality rescue by histone deacetylase inhibitor valproic acid in fatal hemorrhagic shock［J］.J Trauma，2008，65(3):555-565.

［2］Lin T，Chen H，Koustova E，et al.Histone deacetylase as therapeutic target in a rodent model of hemorrhagic shock:effect of different resuscitation strategies on lung and liver［J］.Surgery，2007，141(6):784-794.

［3］Li Y，Liu B，Sailhamer EA，et al.Cell protective mechanisms of valproic acid inlethal hemorrhagic shock［J］.Surgery，2008，144(2):217-224.

［4］方中良，凌濤.組蛋白去乙酰化酶抑制劑在失血性休克與膿毒癥休克治療中的作用研究進展［J］.醫學綜述，2013，19(17):3113-3115.

［5］付春曉，王廣義，卜鳳榮.一種大鼠失血性休克模型的建立［J］.中國應用生理學雜志，2000，16(2):188-190.

［6］馮建華，尤國興，王瑛，等.Wistar大鼠重度失血性休克模型制備影響因素的研究［J］.軍事醫學，2011，35(8):578-581.

［7］Sailhamer EA，Li Y，Smith EJ，et al.Acetylation:A novel method for modulation of the immune response following trauma/hemorrhage and inflammatory second hit in animals and humans［J］.Surgery，2008，144(2):204-216.

［8］Shults C，Sailhamer EA，Li Y，et al.Surviving blood loss without fluid resuscitation［J］.J Trauma，2008，64(3):629-638.

［9］Zacharias N，Sailhamer EA，Li Y，et al.Histone deacetylase inhibitors prevent apoptos is following lethal hemorrhagic shock in rodent kidney cells［J］.Resuscitation，2010，82(1):105-109.

［10］Gonzales ER，Chen H，Munuve RM，et al.Hepatoprotection and lethality rescue by the histone deacetylase inhibitor valproic acid［J］.J Trauma，2008，65(3):554-565.

［11］Hwabejire JO，Lu J，Liu B，et al.Valproic acid for the treatment of hemorrhagic shock:a dose-optimization study［J］.J Surg Res，2014，186(1):363-370.

［12］Dekker SE，Sillesen M，Bambakidis T，et al.Treatment with a histone deacetylase inhibitor，valproic acid，is associated with increased platelet activation in a large animal model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock［J］.J Surg Res，2014，190(1):312-318.

［13］鄧高榮，李宗芳.組蛋白去乙酰化酶抑制劑與失血性休克相關性研究進展［J］.創傷與急危重病醫學，2014，2(6):344-346.

［14］Mai A，Rotili D，Tarantino D，et al.Identification of 4-hydroxyquinolines inhibitors of p300/CBP histone acetyltransferases［J］.Bioorg Med Chem Lett，2009，19(4):1132-1135.