急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞中WT1表達及其與療效、預后的關系

李凌浩，王智，陸時運，趙曉紅，周仲昊，王晨

(南京醫科大學附屬無錫第二醫院，江蘇無錫214002)

Wilms基因(WT1)最早于1990年由 Call等［1］在Wilms瘤中發現，其定位于人類染色體11p13，編碼產物為一鋅指轉錄因子。近年研究發現，WT1可調控造血細胞增生和(或)分化基因的轉錄或激活，與急性髓系白血病(AML)等多種腫瘤性疾病密切相關。近年來，WT1在AML患者中的表達及其與疾病的發生、發展和預后的關系受到廣泛關注。2010年1月～2013年12月，我們觀察了AML患者骨髓單個核細胞中WT1表達水平，并分析其與患者臨床特征、療效及預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期選擇我院收治的初發AML患者56例，男30例、女26例，年齡23～85歲。同期另選非腫瘤患者28例，男17例、女11例，年齡34～78歲，其中營養性貧血12例、感染8例、免疫性血小板減少性紫癜8例。兩組性別、年齡具有可比性。所有研究對象符合《血液病診斷及療效標準》［2］中的相應診斷標準。

1.2 WT1檢測 收集所有研究對象的抗凝骨髓液2 mL，經紅細胞裂解液處理后得到單個核細胞，TRIzol液裂解，提取總RNA，經分光光度儀定量調整RNA 濃度至 0.5 μg/μL。合成 cDNA:配置 40 μL反應體系:隨機引物 2 μL、RNA 4 μL、5 × Buffer液8 μL、逆轉錄酶 1.5 μL、RNA 酶抑制劑 0.6 μL、dNTP 0.5 μL、DEPC 水 23.4 μL，混勻后置于 PCR儀內，反應條件:37℃ 1 h、95℃ 5 min、4℃長期，得到cDNA產物。采用實時定量聚合酶鏈反應(QTPCR)，所有引物和探針由上海生物工程技術有限公司合成。根據文獻［3］設計WT1、ABL基因引物和探針及設置反應條件，將WT1、ABL基因已知陽性模板進行倍比稀釋制作標準曲線，待測樣本中各基因量根據其CT值從標準曲線上讀出，每份標本檢測3次取平均值，以WT1拷貝數/10 000ABL拷貝數作為待測標本WT1基因表達量。判定標準:WT1參照歐洲白血病網標準［4］，以250拷貝數/10 000 ABL拷貝數為界分為高表達組和正常表達組。

1.3 治療方案及效果評價 所有初診AML患者接受標準誘導緩解化療方案，包括DA方案(柔紅霉素45 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)或IA方案(去甲氧柔紅霉素8 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)。參照文獻［2］評價療效，包括完全緩解(CR)、無事件生存(EFS)時間、總生存(OS)時間。

1.4 統計學方法 采用SAS8.1統計軟件。EFS、OS比較采用Wilcoxon檢驗，CR率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML與非腫瘤患者骨髓單個核細胞中WT1表達水平比較 56例AML患者骨髓單個核細胞中WT1表達水平為(10～19 733)拷貝/10 000 ABL拷貝，中位數為2 875拷貝/10 000 ABL拷貝;高表達48例，正常表達8例。28例非腫瘤患者骨髓單個核細胞中WT1表達水平全部＜10拷貝/10 000 ABL拷貝，中位數為8拷貝/10 000 ABL拷貝;無高表達病例。AML患者骨髓單個核細胞中WT1表達水平明顯高于非腫瘤患者(P＜0.01)

2.2 不同WT1表達的AML患者臨床特征 不同WT1表達水平的AML患者年齡、外周血白細胞數量、骨髓原幼細胞比例、LDH水平比較差異均無統計學意義。見表1。

表1 不同WT1表達水平AML患者臨床特征［中位數(95%CI)］

2.3 AML患者WT1表達水平與其他臨床指標的關系 見表2。

表2 不同WT1表達水平AML患者臨床指標比較(例)

2.4 AML患者不同WT1表達水平與療效及預后關系 首次誘導化療后，正常表達組CR 6例，高表達組CR 31例，兩組CR率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。正常表達組EFS時間3～33個月、中位EFS時間22個月，高表達組EFS時間0.5～35個月、中位EFS時間15個月，兩組EFS時間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。正常表達組OS時間7～38個月、中位OS時間29.5個月，高表達組OS時間1～40個月、中位OS時間19個月，兩組OS時間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

研究顯示，WT1具有增強或抑制目的基因轉錄的作用，其目的基因可進一步參與細胞的生長及分化。最初 WT1被作為一種抑癌基因，但近年在AML的研究中發現，其具有致癌作用［5］，目前已作為一種新的AML指標被人們關注。

研究顯示，AML患者普遍存在WT1高表達。本研究中，AML患者WT1表達水平明顯高于非腫瘤患者，AML患者中WT1高表達者占85.7%(48/56)，與以往報道一致。研究結果顯示，WT1表達水平的高低與患者性別、年齡、外周血白細胞數量、骨髓原幼細胞比例無關，與Yang等［5］報道一致。本研究還發現，WT1表達水平的高低與血清LDH水平亦無相關性，提示其為一種獨立于以上指標的新的AML臨床指標。

本研究結果顯示，WT1表達正常者與WT1高表達AML患者首次誘導化療后CR率相當，但WT1表達正常AML患者EFS、OS時間更長。提示AML骨髓單個核細胞中WT1表達正常者可能獲得更好的療效和預后。目前，有關WT1表達水平與AML患者療效間的關系尚存在爭議，多數學者認為WT1高表達者預后較差［6～12］，也有學者認為 WT1表達水平對預后無指導意義或預后較好［13～15］。關于WT1在AML中預后意義的不同研究結果可能與患者數量、多種其他預后因素影響、WT1基因突變及眾多WT1亞型等復雜因素有關，其能否成為AML的獨立預后指標還有待商榷。

綜上所述，AML患者骨髓單個核細胞WT1水平較非腫瘤患者明顯高表達;AML患者WT1表達水平與患者性別、年齡、外周血白細胞數量、骨髓原幼細胞比例、血清LDH水平無關，可能與療效、EFS時間、OS時間有關，尚需進一步擴大樣本量加以驗證。

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