microRNA-99b過表達對宮頸癌細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響

姜麗，王燕

(煙臺海港醫院，山東煙臺264000)

有研究發現，miRNA-99b(miR-99b)在人乳頭瘤狀病毒(HPV)陽性的宮頸腺癌組織中低表達［1～4］，但miR-99b在宮頸癌惡性轉化中的作用尚不清楚。本研究探討上調miR-99b表達對宮頸癌細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響，為宮頸癌的藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌組織及癌旁組織標本取自2013年9月～2014年9月本院住院治療的24例宮頸癌患者，年齡(54.27±4.62)歲，病歷及隨訪資料詳實完整，為原發性宮頸癌，無其他合并癥，病理診斷為腺癌或鱗癌，所有患者均簽署知情同意書。取上述患者的癌旁或鱗癌的遠端上皮組織，并經病理檢查證實無癌細胞浸潤，作為對照。宮頸癌細胞(HPV-18陽性 HeLa細胞系、C4-1細胞系，HPV-16陽性CaSki細胞系、SiHa細胞系)均購于北京中原公司。順鉑、卡鉑購自齊魯制藥公司。

1.2 細胞培養及轉染 將HeLa細胞、C4-1細胞、CaSki細胞、SiHa細胞用含10%Gibco胎牛血清的高糖DMEM培養基進行培養，內含雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。當細胞融合率達到80%時，用0.25%胰酶消化，進行傳代，并置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養。將細胞鋪于6孔板或96孔板，待細胞融合度達70%，進行轉染。用LipofectamineTM2000(購自 Invitrogen公司)試劑分別將miR-99b、陰性對照Scramble(均購自廣州銳博公司)轉染至Hela細胞、C4-1細胞、CaSKi細胞、SiHa細胞。轉染方法嚴格按照說明書進行操作，轉染后的細胞繼續培養48 h。

1.3 miRNA的提取、擴增及檢測 用miRNA快速提取試劑盒(購買自北京天根公司)提取宮頸癌組織、癌旁組織、正常宮頸上皮組織及Hela細胞、C4-1細胞、CaSKi細胞、SiHa細胞中miRNA，提取得到的總RNA樣本于-80℃存儲。取2 μg總RNA進行逆轉錄合成cDNA，并嚴格按照逆轉錄試劑盒(購自北京天根公司)進行擴增，DEPC水5.3 μL，RT-PCR緩沖液 2 μL，上下游引物(購自銳博公司)各0.1 μL，RNA 酶抑制劑 0.1 μL，混合酶 0.4 μL，底物1 μL。42℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。使用 SYBR Real-time PCR detection kit熒光定量PCR檢測試劑盒(購自北京天根公司)對miR-99b的表達進行檢測。

1.4 細胞增殖測定 采用CCK-8法。在96孔板中接種濃度為1×104個/mL的細胞懸液(100 μL/孔)。將培養板放培養箱預培養。于培養12、24、36、48 h，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育2 h。用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(OD)值，根據公式計算細胞增殖活力。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。使用24孔BD基質膠侵襲小室(購自BD Biosciences公司)進行細胞侵襲能力檢測。將每組轉染不同片段細胞用胰酶消化后，使用無血清培養基進行重懸。將200 μL細胞懸液加入上室，下室則加入800 μL含10%胎牛血清的完全培養基，置于細胞培養箱中培養24 h。取出Transwell小室，使用濕棉簽拭去小室膜上未侵襲的細胞，底部細胞用3%多聚甲醛固定，并用0.1%結晶紫進行染色，33%乙酸萃取，使用酶標儀于波長570 nm處檢測。以空白對照組測得的OD值為1，轉染Scramble組和轉染miR-99b組的侵襲能力為兩組的OD值與空白對照組OD值之比。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.6 轉染后宮頸癌細胞半數有效抑制濃度(IC50)測定 采用CCK-8法。取miRNA轉染后宮頸癌細胞，加入順鉑或卡鉑處理細胞(對每一組細胞，控制順鉑的最終濃度分別為:1、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10 μg/mL;卡鉑的最終濃度分別為:0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6 、0.7 、0.8 、0.9 、1.0 μg/mL)，加入藥品后48 h，向相應孔中加入10 μL的 CCK-8溶液，在培養箱內繼續孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的OD值，并使用Origin8.5.1軟件計算IC50。

1.7 統計學方法 采用SAS9.2統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-99b在宮頸癌細胞中的表達水平比較

宮頸癌HeLa細胞系、C4-1細胞系、CaSki細胞系、SiHa細胞系中miR-99b的表達水平分別為0.64±0.08、0.31 ±0.06、0.45 ±0.07、0.23 ±0.04，均低于正常宮頸上皮組織(1.00±0.00)(P均＜0.05)，C4-1細胞系和SiHa細胞系中miR-99b的表達水平較HeLa細胞系和CaSki細胞系更低。

2.2 miRNA-99b對宮頸癌細胞株增殖活力的影響見表1。

2.3 miR-99b對宮頸癌細胞株侵襲能力的影響見表2。

2.4 miR-99b對宮頸癌細胞株化療敏感性的影響見表3。

表1 轉染后宮頸癌細胞株的增殖活力比較(±s)

表1 轉染后宮頸癌細胞株的增殖活力比較(±s)

注:與同種細胞空白對照組、轉染Scramble組比較，*P＜0.05。

細胞增殖活力0 h 12 h 24 h 36 h 48 h Hela 細胞空白對照組 1±0.00 2.2±0.21 3.6±0.34 5.1±0.55 8.7±0.83轉染Scramble組 1±0.00 1.8±0.16 3.1±0.29 5.8±0.59 9.1±0.97轉染miR-99b組 1±0.00 1.7±0.19 3.4±0.36 4.1±0.46 6.1±0.66*C4-1細胞空白對照組 1±0.00 2.2±0.24 2.6±0.28 4.1±0.41 6.2±0.56轉染Scramble組 1±0.00 1.9±0.18 3.0±0.31 3.8±0.39 5.8±0.62轉染miR-99b組 1±0.00 1.8±0.20 2.4±0.25 3.1±0.30 4.1±0.39*CaSKi細胞空白對照組 1±0.00 1.7±0.16 2.7±0.29 3.7±0.33 5.7±0.52轉染Scramble組 1±0.00 1.9±0.18 2.9±0.30 3.8±0.39 4.8±0.51轉染miR-99b組 1±0.00 1.5±0.14 2.4±0.23 3.1±0.29 3.3±0.33*SiHa細胞空白對照組 1±0.00 2.2±0.23 3.5±0.37 5.0±0.52 7.5±0.77轉染Scramble組 1±0.00 1.9±0.20 3.1±0.33 5.5±0.57 7.2±0.74轉染miR-99b組 1±0.00 1.7±0.19 3.4±0.31 4.1±0.44 5.1±0.53*

表2 轉染后宮頸癌細胞株的侵襲能力比較(±s)

表2 轉染后宮頸癌細胞株的侵襲能力比較(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別細胞空白對照組侵襲能力Hela細胞 C4-1細胞 CaSKi細胞 SiHa 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00轉染Scramble組 0.92±0.15 1.07±0.18 1.18±0.31 0.89±0.21轉染miR-99b組 0.41±0.10*0.37±0.12*0.51±0.21*0.46±0.15*

3 討論

宮頸癌主要分為鱗癌和腺癌兩種［5］。在宮頸上皮細胞惡性轉化的過程中，高危型HPV發揮重要作用，HPV-16、HPV-18 與宮頸腺癌密切相關［6］，但宮頸癌發生的具體分子機制尚不清楚。目前，化療是治療宮頸癌的重要手段，以鉑類藥物為基礎的化療結合放療是治療晚期宮頸癌的主要方法［7］。但隨著化療時間的延長，腫瘤細胞會對鉑類化療藥物逐漸產生耐藥性，導致宮頸癌治療失敗［8］。因此，如何提高宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性是治療的關鍵［9］。

miRNA是生物體中存在的重要的基因調控因子，與腫瘤的發生發展密切相關［10］。不同化療藥物對miRNA的表達會有影響，并且許多miRNA與腫瘤細胞對藥物的敏感性也密切相關。Turcatel等［11］發現在正常小鼠乳腺細胞中，miR-99a和miR-99b能夠調節TGF-β誘導的乳腺上皮細胞的間質轉化;Kang等［12］研究表明，在非小細胞肺癌中，miR-99b通過直接調控靶基因成纖維細胞生長因子受體3發揮抑制腫瘤發生發展的作用;miR-99b還可通過調控mTOR信號通路增強放療敏感性［13］。然而，目前miR-99b對宮頸癌細胞化療敏感性影響的報道不多，其發揮功能的具體分子生物學機制仍不清楚。

表3 轉染后宮頸癌細胞株對抗腫瘤藥物的IC50值比較(μg/mL，±s)

表3 轉染后宮頸癌細胞株對抗腫瘤藥物的IC50值比較(μg/mL，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01。

IC50組別 順鉑 卡鉑空白對照組Hela細胞 3.18±0.35 0.69±0.08 C4-1細胞 4.15±0.28 0.76±0.09 CaSKi細胞 2.18±0.35 0.39±0.07 SiHa細胞 5.18±0.65 0.57±0.06轉染Scramble組Hela細胞 3.56±0.41 0.64±0.07 C4-1細胞 3.82±0.18 0.69±0.07 CaSKi細胞 2.56±0.31 0.44±0.05 SiHa細胞 5.36±0.51 0.52±0.07轉染miR-99b組Hela細胞 2.35±0.31* 0.31±0.02#C4-1細胞 2.44±0.11# 0.41±0.04*CaSKi細胞 0.75±0.21# 0.21±0.03*SiHa細胞 2.75±0.41# 0.21±0.02#

在本研究中，使用熒光定量PCR法對宮頸癌四種細胞系中miR-99b的表達水平進行檢測，結果發現，miR-99b在宮頸癌細胞系中的表達均低于正常宮頸上皮組織，這提示miR-99b在宮頸癌組織中的低表達可能具有某種生物學意義。用miR-99b Mimics轉染宮頸癌細胞系，成功構建了miR-99b的過表達體系。CCK-8檢測結果發現，與轉染Scramble組相比，miR-99b過表達組中四種宮頸癌細胞系的增殖能力均受到了明顯的抑制，這表明miR-99b具有抑制宮頸癌細胞增殖的作用。同樣，Transwell檢測結果則顯示與Scramble組相比，miR-99b過表達組中四種宮頸癌細胞系的侵襲能力明顯下降，這表明miR-99b具有抑制宮頸癌細胞侵襲的能力。結果還發現，與Scramble組相比，miR-99b過表達組中IC50數值均明顯降低，細胞對順鉑、卡鉑的敏感性明顯增強，這表明miR-99b能夠改善宮頸癌細胞對化療藥物的耐藥性。

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