消乳塊膠囊對乳腺腫瘤模型大鼠血漿IGF-1水平的影響

陳占紅陳雪琴邵喜英許維丹王曉稼

消乳塊膠囊對乳腺腫瘤模型大鼠血漿IGF-1水平的影響

陳占紅1陳雪琴2邵喜英1許維丹3王曉稼1

目的 觀察消乳塊膠囊對乳腺腫瘤模型大鼠血漿胰島素樣生長因子-1（IGF-1）水平的影響。方法 64只50日齡SD健康雌性未孕大鼠隨機分為模型組、治療組各25只和對照組14只。模型組和治療組大鼠均先經2次9，10-二甲基苯蒽（DMBA，15mg溶于1.5mL芝麻油，間隔1周）灌胃造模，同時治療組大鼠以消乳塊膠囊0.4g/（kg·d）灌胃，持續給藥,在第11周和14周分批處死大鼠，取乳腺組織及腫瘤組織作常規病理檢查，酶聯免疫吸附法測定血漿IGF-1水平。結果 與病理表現正常大鼠相比，乳腺癌變及增生大鼠血漿IGF-1水平升高明顯［（138.65±8.54）ng/mL、（212.32± 10.38）ng/mL比（97.70±5.16）ng/mL，P＜0.01］，癌變大鼠增高更為明顯，與增生大鼠相比，差異有統計學意義［（212.32±10.38）ng/mL比（138.65±8.54）ng/mL，P＜0.05］。模型組、治療組11、14周時血漿IGF-1較對照組明顯增高［11周：（196.99±7.85）ng/mL、（142.33±8.62）ng/mL比（101.46±7.07）ng/mL，P＜0.01；14周：（229.40±13.37）ng/mL、（138.75±8.82）ng/mL比（90.26±2.50）ng/mL，P＜0.01］，治療組11、14周血漿IGF-1水平較模型組有明顯下降［11周：（142.23±8.62）ng/mL比（196.99±7.85）ng/mL，P＜0.01；14周：（138.75±8.82）ng/mL比（229.40±13.37）ng/mL，P＜0.01］。結論 消乳塊膠囊對DMBA誘導的大鼠乳腺惡性腫瘤具有部分預防作用，其機制可能是通過降低血漿IGF-1水平來實現。

大鼠；乳腺腫瘤；消乳塊膠囊；胰島素樣生長因子-1

消乳塊膠囊是鄭樹教授根據乳腺良性增生癥臨床特征和育齡婦女生理特點，以及中醫肝郁氣滯生乳癖、疏肝理氣消乳癖理論設計組成的中西藥復方制劑，在治療乳腺增生、緩解乳房疼痛等方面有較滿意的臨床療效。我們前期實驗結果發現消乳塊膠囊對DMBA誘導的大鼠乳腺惡性腫瘤有預防作用，其機制可能是通過ERβ介導的保護作用和和調節體內激素水平來實現[1-2]。有文獻[3]報道，在乳腺癌的發病過程中，血漿胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）與雌二醇相互作用，刺激乳腺上皮細胞的增生，從而使乳腺癌的發病危險性升高。本研究觀察消乳塊膠囊對9，10—二甲基苯蒽（9，10-dimethylben（a）Anthracene，DMBA）誘發SD大鼠乳腺腫瘤的IGF-1水平的影響，為進一步認識乳腺增生病和乳腺癌的形成過程、深入研究乳腺增生病和乳腺癌發病機制、尋求有效防治藥物奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動 物 50日齡Sprague-Dawley系雌性未孕大鼠64只，平均體質量約180g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（浙2003-0003），置于室溫21°C、相對濕度30%～70%、自然光照和基礎飼料喂養。

1.2 試劑和儀器 9，10—二甲基苯并蒽（SIGMA公司，批號076 K9430）；消乳塊膠囊（浙江大學醫學院附屬第二醫院制劑室制備，規格：0.4g/粒，批號20050312）；大鼠IGF-I定量ELISA試劑盒（上海西唐生物技術有限公司，批號2007080，光學顯微鏡（日本奧林巴斯）；BIO-RAD Model 680酶標儀（美國伯樂）。

2 實驗方法

2.1 造模及給藥 64只SD大鼠常規飼養4天后隨機分為模型組25只，治療組25只和空白對照組14只。模型組和治療組大鼠分別給予DMBA行乳腺腫瘤造模（每次用DMBA15mg溶于1.5mL芝麻油中灌胃，間隔1周），對照組以1.5mL芝麻油灌胃模擬造模；治療組給予濃度為0.048g/mL的消乳塊膠囊溶液1.5mL灌胃，每天1次，連續給藥2周后改每周5次；模型組和對照組均僅以同等體積0.5%羧甲基纖維素鈉鹽溶液（CMC）灌胃。給藥第9周根據實際體質量調整劑量1次。持續給藥，分別在第11周和第14周分批處死，先按體質量給予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，采血3mL，肝素鋰抗凝，30min內3000r/min離心10min，提取血漿，置-30℃冰柜中保存待查。取出大鼠乳腺組織及腫瘤分別置于4%甲醛溶液中固定12h。

前期實驗期間模型組、治療組分別有3只大鼠在早期死亡且未見腫塊產生。死因主要為肺部感染、肝臟壞死等，可能與DMBA毒性和灌胃不當致氣道阻塞有關。模型組1只大鼠在荷瘤生長后期死亡。

2.2 病理學觀察 分別于第11周及第14周時處死大鼠，取乳腺組織及腫塊分別置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察。大鼠乳腺組織學分級：首先由兩位資深的病理學專業人員在不了解動物實驗分組的情況下，按乳腺組織學分級標準判定大鼠乳腺組織學分級，具體分為三個等級，分別為正常、增生和癌變。當兩位專家有分歧時，則參考第三位病理學專家的意見。

2.3 血漿IGF-1水平測定 用ELISA法測定血漿IGF-1的含量，具體方法按試劑盒提供的說明書操作。

2.4 統計學方法 各組動物癌變率比較用Fisher確切概率法檢驗。血清激素水平以均數加減標準差（±s） 表示，各組之間的比較采用隨機區組設計資料的方差分析。所有數據經SPSS15.0軟件包處理。

3 實驗結果

3.1 大鼠乳腺組織病理學觀察 第11周大鼠乳腺組織和腫塊鏡下觀察發現，除空白對照組外，大多數大鼠有不同程度的增生，但僅一例發生癌變，癌變率7.14%，三組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。而到14周時實驗組所有大鼠均發生增生或癌變，其中模型組癌變率83.3%，治療組癌變率25.0%，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結束時總共留取大鼠病理標本57份，其中病理表現正常的大鼠20只，增生大鼠29只和癌變大鼠8只。

3.2 不同病理類型大鼠血漿IGF-1水平比較 病理表現為增生及癌變的大鼠血漿IGF-1水平與病理表現為正常的大鼠血漿IGF-1水平比較有明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01），并且以癌變大鼠升高更為明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 不同病理類型大鼠血漿IGF-I水平比較（ng/mL，±s）

表1 不同病理類型大鼠血漿IGF-I水平比較（ng/mL，±s）

注：與正常大鼠比較，*P＜0.01；與增生大鼠比較，△P＜0.05

病理類型正常增生癌變只數20 29 8 IGF-1 97.70±5.16 138.65±8.54* 212.32±10.38*△

3.3 三組大鼠血漿IGF-1水平比較 模型組和治療組11、14周時大鼠血漿IGF-1水平較對照組有明顯增高（P＜0.01），模型組升高較治療組更明顯（P＜0.01）；且模型組在14周時IGF-1水平比11周時明顯增高（P＜0.05）。另兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組大鼠血漿IGF-1水平比較（ng/mL，±s）

表2 三組大鼠血漿IGF-1水平比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與11周時比較，△P＜0.01

組別對照組模型組治療組只數14 25 25 11周101.46±7.07 196.99±7.85* 142.23±8.62*▲14周90.26±2.50 229.40±13.37*△138.75±8.82*▲

4 討 論

乳腺癌病因復雜，中醫認為，乳腺癌的病機是肝氣不舒，氣機運行不暢，致使經絡、臟腑、氣血、陰陽失調，氣滯血瘀，痰凝聚瘕，蘊毒成瘤。“消乳塊膠囊”正是根據這一理論將中藥昆布和維生素等合成復方制劑，臨床應用對乳腺良性增生病的癥狀控制較滿意，特別對緩解乳房疼痛效果較明顯。在我們前期研究工作中發現該藥物還具有預防和抗腫瘤作用，但其作用機制尚待明確[1-2]。

本實驗結果提示在第11周時致癌率低，全組只有1例癌變；在第14周時模型組與治療組均發現有不同程度的增生或癌變，癌變率為83.3%。提示DMBA的致癌作用與時間相關，與早期Talang等報道的結果相似[4]。

IGF-1是生長調節素的一種，具有廣泛的生物學作用。在乳腺癌中，可促進腫瘤細胞的生長，抑制腫瘤細胞的正常凋亡，同時增強其轉移，并認為與乳腺癌內分泌微環境變化關系密切[5-8]。Tamimi等[9]研究發現IGF-1受體表達與乳腺癌的風險增加有關。文獻[6，10]報道，針對IGF-1靶點治療晚期乳腺癌的體內外試驗取得一定成功。本實驗結果發現，血漿IGF-1在正常、增生、癌變大鼠中的水平逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.01），這提示IGF-1與乳腺腫瘤的形成可能有關聯，與文獻報道IGF-I促進腫瘤生長轉移相一致。

本實驗結果還表明，大鼠血漿IGF-1水平在11周和14周時，模型組、治療組血漿水平較對照組比較有明顯增高，并且以模型組升高更為明顯，治療組較模型組明顯降低（P＜0.01），這提示IGF-1可能參與DMBA誘導大鼠乳腺癌的形成過程，消乳塊膠囊可以在一定程度上抑制IGF-1的表達，這可能是消乳塊膠囊抑制大鼠乳腺惡性腫瘤生成的又一途徑。模型組IGF-1水平在14周時比11周時有增高（P＜0.05），考慮與14周時癌變率高相關，治療組11周與14周IGF-1水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），這與消乳塊膠囊對DMBA誘導大鼠乳腺惡性腫瘤的抑制作用相關。有研究表明，雌二醇可調節IGF-1和IGF-1R的表達，使乳腺癌細胞對IGF-1敏感性增加，反之IGF-1與IGF-1R結合通過影響細胞內的蛋白合成翻譯過程而影響雌激素受體的表達，從而影響雌激素的作用[11-12]。對于DMBA誘導大鼠乳腺癌形成的分子特征，文獻認為多為激素依賴性[13]，我們前期實驗中也得到相同的結果[2]。而關于IGF-1與雌二醇的關系我們將在下一步的研究中繼續探索。

［1］王曉稼，鄭樹.消乳塊膠囊預防乳腺腫瘤的實驗研究［J］.實用腫瘤雜志，2002，17（2）：114-116.

［2］陳占紅，王曉稼.消乳塊膠囊抑制DMBA誘發大鼠乳腺癌及其機制［J］.中華中醫藥學刊，2009，11（5）：1031-1033.

［3］Martin MB，Stoica A.Insulin-like growth factor-i and estrogen interactions in breast cancer［J］.允Nutr，2002，132（12）：3799S-3801S.

［4］Telang NT，Kurihara H，Wong GY，et al.Preneoplastic transformation in mouse mammary tissue：Identification and validation of intermediate biomarkers for chemoprevention［J］. Anticancer Res，1991，11（3）：1021-1027.

［5］允ackson允G，Zhang X，Yoneda T，et al.Regulation of breast cancer cell motility by insulin receptor substrate-2（irs-2）in metastatic variants of human breast cancer cell lines［J］. Oncogene，2001，20（50）：7318-7325.

［6］Sachdev D，Li SL，Hartell允S，et al.A chimeric humanized single-chain antibody against the type i insulin-like growth factor（igf）receptor renders breast cancer cells refractory to the mitogenic effects of igf-i［J］.Cancer Res，2003，63（3）：627-635.

［7］Shi R，Yu H，McLarty允，et al.IGF-1 and breast cancer：a meta-analysis［J］.Int允Cancer，2004，111（3）：418-423.

［8］Morgillo F，De Vita F，Antoniol G，et al.Serum insulin-like growth factor 1 correlates with the risk of nodal metastasis in endocrine-positive breast cancer［J］.Curr Oncol，2013，20（4）：e283-288.

［9］Tamimi RM，Colditz GA，Wang Y，et al.Expression of IGF-1R in normal breast tissue and subsequent risk of breast cancer［允］.Breast Cancer Res Treat，2011，128（1）：243-250.

［10］Saldana SM，Lee HH，Lowery F允，et al.Inhibition of type I insulin-like growth factor receptor signaling attenuates the development of breast cancer brain metastasis［J］.PLoS One，2013，8（9）：e73406.

［11］Oesterreich S，Zhang P，Guler RL，et al.Re-expression of estrogen receptor alpha in estrogen receptor alpha-negative mcf-7 cells restores both estrogen and insulin-like growth factor-mediated signaling and growth［J］.Cancer Res，2001，61（15）：5771-5777.

［12］Hawsawi Y，El-Gendy R，Twelves C，et al.Insulin-like growth factor-oestradiol crosstalk and mammary gland tumourigenesis［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1836（2）：345-353.

［13］Iino Y，Izuo M，Horiuchi R.Estrogen and progesterone receptor levels in 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced rat mammary tumors in each week-check points about experimental studies using dmba-induced tumors［J］.允pn允Exp Med，1990，60（6）：351-354.

（收稿：2015-02-06 修回：2015-05-19）

Effect of"Xiao Rukuai"Capsule on Plasma Insulin-like Growth Factor-1 in Rats with Mammary Tumor

CHEN Zhanghong1,CHEN Xueqin2,SHAO Xiying1,XU Weidan3,WANG Xiaojia1. 1 Department of Oncology, Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;2 Biological Treatment of Cancer,Hangzhou Cancer Hospital, Hangzhou(310002),China;3 College of Medicine and Health,Lishui University,Lishui(323000),China

Objective To investigate the anticancer effect of"Xiao Rukuai"capsule on plasma insulin-like growth factor-1（IGF-1）in rats with mammary tumor.Methods Sixty-four 50-day-old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups∶model group（n=25）,therapy group（n=25）,and control group（n=14）.Model group and therapy group were given DMBA by intragastric administration（15mg in 1.5mL sesame oil,twice,one week interval）.Rats in therapy group were given additonal"Xiao Rukuai"capsule[0.4g/（kg·d）]by intragastric administration. All rats were killed in 11th or 14th week.The breast tissue or neoplasma were observed by routine pathology.The plasma IGF-1 levels were detected by ELISA assay.Results Compared to normal group,the levels of IGF-1 were remarkably higher in the cancerous and hyperplastic group（138.65±8.54ng/mL and 212.32±10.38ng/mL vs 97.70± 5.16ng/mL,P＜0.01）;a significant difference was found between cancerous group and hyperplasia group（212.32± 10.38ng/mL vs 138.65±8.54ng/mL,P＜0.01）.At 11th and 14th week,the levels of IGF-1 in the plasma in model and therapy group were significantly higher than that in control group（at 11th week∶196.99±7.85ng/mL and 142.33± 8.62ng/mL vs 101.46±7.07ng/mL;at 14th week∶229.40±13.37ng/mL and 138.75±8.82ng/mL vs 90.26±2.50ng/mL;all P＜0.01）.After"Xiao Rukuai"capsule treatment,the levels of IGF-1 reduced remarkably,with a significant difference compared to that in model group（at 11th week∶142.33±8.62ng/mL vs 196.99±7.85ng/mL;at 14th week∶138.75± 8.82ng/mL vs 229.40±13.37ng/mL;all P＜0.01）.Conclusion The"Xiao Rukuai"capsule has partly effect on preventing the mammary carcinogenesis induced by DMBA.The mechanism may be associated with regulating IGF-1 levels.

"rats;mammary tumor;"Xiao Rukuai"capsule;insulin-like growth factor-1

1浙江省腫瘤醫院乳腺腫瘤內科（杭州 310022）；2杭州市腫瘤醫院腫瘤生物治療中心（杭州 310002）；3麗水學院醫學與健康學院（麗水323000）

王曉稼，E-mail：wxiaojia0803@163.com