不同濃度葡聚糖硫酸鈉對小鼠炎癥性腸病模型建立及其致病相關免疫因子表達的影響

李欣，武文卿，張卓超，俎占飛，毛旭燕，朱恒 ，寧守斌*

1.中國人民解放軍空軍總醫院消化科，北京 100142;2.軍事醫學科學院科技部，北京 100850;3.軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組發病原因尚不明確的慢性非特異性的炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，其發生發展與遺傳易感性、外部環境、感染介質、腸道共生菌及免疫系統的功能障礙等多因素相互作用有關［1］，主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、粘液膿血便、體重減輕，長期發展亦有癌變的風險［2］，因此IBD相關研究日益受到重視。采用動物模型開展研究具有受倫理學限制少，便于取材等優勢。目前常用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)溶于水中給予小鼠飲用建立IBD模型，其病理改變與人臨床病理改變接近［3］。但是，不同研究小組建立DSS誘導的 IBD模型的方法并不統一，所用小鼠周齡(4～16周)、小鼠品系(KM、BALB/c、C57BL/6和 C57BL/10等)、DSS濃度(2% ～10%)和自由飲水時間(5～10 d)等多個因素均不相同，成模率也高低不等，這些不利于利用動物模型開展炎癥性腸病的研究。

我們在大量調研文獻的基礎上，通過采用不同濃度的DSS溶液自由飲用以建立炎癥性腸病C57小鼠模型，系統探討DSS濃度對IBD成模率和動物死亡率及致病相關免疫因子表達的影響，以期篩選出成模穩定、可操作性好、成模率高的模型，從而為IBD的治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性C57BL/6J小鼠64只，19～21 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［SCXK:(京)2012－0001］，動物實驗場所號為SYXK－軍2012－0065。喂養前適應性喂養3～5 d。DSS購自默克公司，相對分子質量為36×103～50×103白色粉末狀固體，DSS與去離子水分別配置濃度為3%、5%、7%的DSS水溶液。

1.2 動物分組

對照組(n=16):自由飲水組;實驗－1組(n=16):3%－DSS 溶液組;實驗－2 組(n=16):5%DSS 溶液;實驗－3組(n=16):7%DSS溶液組。

1.3 DSS誘導小鼠IBD模型制備

小鼠自由飲用3%、5%、7%DSS溶液，建立IBD模型，新鮮的DSS溶液每隔1 d更換1次，正常對照組小鼠飲用去離子水。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 一般指標

觀察小鼠大便性狀、體重改變和生存情況。

1.4.2 小鼠結腸組織大體觀察及評分

DSS誘導的IBD小鼠模型其結腸大體病理改變主要為結腸縮短和水腫，Egger等研究發現IBD小鼠結腸的長度變化可以用來評價炎癥嚴重程度。模型建立的第6天處死小鼠，取出結腸部分，觀察結腸的大體形態，測量肛門至盲腸末端的長度。病理評分按照Morris［4］的評分標準進行:0分:基本正常;1分局部充血，未見潰瘍;2分無充血，有潰瘍;3分:潰瘍和炎癥僅有1處;4分:有兩處以上的潰瘍和炎癥;5分:潰瘍長度大于2 cm;6～10分:大于2 cm的潰瘍，每增加1 cm多計1分。

1.4.3 小鼠結腸組織學觀察及評分

隨機取含病變腸組織并去除腸內容物，以4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，行蘇木素伊紅(HE)染色。組織學評分按照Scheiffele等［5］的評分標準進行:0分:無顯著炎癥;1分:僅見少量淋巴細胞浸潤(高倍視野，≤10%)，其無腸壁結構改變:2分:中等數量的淋巴細胞浸潤(高倍視野，10% ～25%)，腸壁增厚，腸隱窩變長，但無透過黏膜層的潰瘍;3分:顯著的淋巴細胞浸潤(高倍視野，25% ～50%)，腸壁增厚，血管密度增加:4分:腸壁內可見大量的淋巴細胞浸潤全層(高倍視野，≥50%)，腸隱窩變長并扭曲，有潰瘍形成，腸壁全層增厚，血管密度增加。

1.4.4 小鼠脾細胞炎癥因子的表達檢測

建模后6 d處死小鼠，解剖取脾，收集脾細胞，Trizol提取RNA，逆轉錄成cDNA，逆轉錄體系按照試劑盒說明配置，RT－PCR檢測促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)，抑炎因子(IL－4 和 IL－10)以及調節性T細胞相關的轉錄因子Foxp3的表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠飲水狀況(見表1)

表1 各組小鼠飲水量(n=16)Tab.1 The drinking amount of the mice in each group

2.2 小鼠一般狀況

對照組小鼠精神活躍，大便性狀正常，毛發光澤好且順滑。

3%DSS組小鼠造模后精神稍差，多為半稀便，少許粘肛，可見輕微的肉眼血便。

5%DSS組小鼠造模后精神差、懶惰，肉眼血便，飲食減少，部分小鼠出現豎毛、弓背現象。

7%DSS組小鼠造模后精神倦怠，懶惰，拱背，扎堆，毛發無光澤、豎毛現象，可見明顯肉眼純稀血便。

2.3 小鼠體重變化

各組小鼠自由飲用不同濃度的DSS溶液后體重變化(見圖1)。

對照組小鼠體重持續增加，實驗組小鼠DSS(3%、5%、7%)組前3 d體重均緩慢增加，4 d體重迅速下降，且隨著DSS濃度的增加小鼠體重下降幅度越大。第6天時，3%DSS、5%DSS、7%DSS 飲用組的小鼠體重降低百分率分別為16.26%、17.95%、20.62%。

圖1 各組小鼠體重改變Fig.1 Changes of body weight of the mice in each group

2.4 結腸大體病理學觀察

各組小鼠結腸肉眼大體形態觀見(圖2)實驗組與對照組相比結腸明顯縮短。進一步觀察可見，對照組小鼠結腸腸壁較薄，顏色紅潤，褶皺清晰;3%DSS組小鼠腸壁水腫，褶皺變淺，輕微充血;5%DSS組小鼠腸腔充血水腫，可見潰瘍，伴有少量壞死;7%DSS組小鼠腸腔可見明顯潰瘍，伴有大面積壞死，局部腸壁增厚，腸腔狹窄。

大體形態學和組織學評分結果如(表2)所示，可見隨著飲用的DSS溶液濃度的提升，小鼠結腸的大體病理損害逐漸加重。

表2 炎癥性腸病小鼠結腸評分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

表2 炎癥性腸病小鼠結腸評分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

組別Groups成模率/%Modeling success rate對照組Control Group 0.0 0.0 03%DSS組3%DSS Group 3.54±0.07 2.53±0.38 1005%DSS組5%DSS Group 4.46±0.09 3.61±0.08 1007%DSS組大體評分General scores病理評分Pathologic scores 7%DSS Group 6.73±0.21 4.64±0.06 100

2.5 組織病理學觀察

組織病理學的HE染色結果(如圖3)示，對照組小鼠腸黏膜層、肌層和腸腺體結構清晰，組織結構完整;3%DSS組小鼠腸壁增厚，有炎癥細胞浸潤，黏膜層和肌層結構不清，腸腺體結構消失;5%DSS組小鼠腸壁水腫增厚更加明顯，大量炎性細胞浸潤;7%DSS組小鼠除了具有前述表現外，可見腸黏膜壞死脫落，炎性細胞浸潤至全層。

2.6 IBD發病相關免疫因子的表達情況

如圖4所示，定量 PCR結果表明促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)的表達水平與 DSS 濃度成正相關，而抑炎因子(IL－4和IL－10)以及調節性T細胞相關的轉錄因子Foxp3的表達水平與DSS濃度成負相關關系。

圖2 各組小鼠結腸大體形態觀Fig.2 Gross appearance of the colon in the mice

圖3 各組小鼠組織病理分析Fig.3 Histological analysis of the colon in the mice of each groupe.Bar=100 μm

圖4 各組免疫分子mRNA相對表達量(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.4 The relative mRNA levels of immune factors in the mice of each group(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01).

2.7 各組小鼠生存率

建模第6天時，飲用不同濃度DSS的小鼠的病理表現均表現為典型的炎性腸病損害。但是，各組小鼠的死亡率出現差異，分別為:3%組為18.2%，5%組為33.3%，7%組為50%，以7%組的死亡率分別和3%組以及5%組進行比較，發現這種差別具有統計學意義(圖5)(P＜0.05)。

圖5 各組小鼠存活百分率Fig.5 Survival curves of the mice in each group

3 討論

IBD的發病機制至今尚無定論，現認為可能與環境、遺傳、微生物感染及免疫等多種因素有關，其中，免疫因素在潰瘍性結腸炎發病機制中尤為重要［6］。目前常用的模擬人類IBD的動物模型采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導制備，DSS是一種硫酸多聚糖，由蔗糖合成而來，其具有和肝素相似的抗凝血作用。DSS誘導結腸炎發生的具體機制不詳，可能和其導致腸道菌群失調、DSS對結腸上皮的毒性作用以及巨噬細胞功能失調有關，也可能與DSS促進炎性細胞因子 TNF－α/、IFN－γ、IL－17A 等的表達及與嗜酸性細胞脫顆粒有關［7］。DSS誘導炎癥性腸病模型簡單易行，成功率高，重復性好，其癥狀、結腸肉眼病變和組織學改變均與人類IBD相似，且可人為地反復以DSS刺激，產生與人類IBD急性期和緩解期相似的病理改變［8］，是研究IBD發病機制和藥物療效比較合適的動物模型。

多項研究結果顯示，DSS－IBD模型的建立主要受動物種系、DSS濃度，DSS相對分子質量，DSS暴露時間等因素的影響［9］。其中DSS濃度對模型的成功建立起著決定性的作用。本實驗開展C57BL/6小鼠自由飲用去離子水、3%、5%、7%相對分子質量為36000～50000 DSS溶液造模實驗，主要目的是探索最佳造模濃度和時間及探討不同濃度的DSS對小鼠炎癥因子表達的影響。通過開展本研究，我們篩選出了既能獲得典型病理改變，又不犧牲過多實驗動物的合理DSS給藥濃度，具有良好的經濟效益和動物倫理學價值。

在IBD的發生和發展過程中炎癥細胞因子與抗炎細胞因子之間的平衡失調起著重要的作用，測定細胞因子 TNF－α、IFN－γ、IL－17A、IL－4、IL－10 以及調節性T細胞相關的轉錄因子Foxp3的表達水平的水平可反映IBD的病情變化，同時也便于開展深入的發病機制研究。以往研究表明，TNF－α、IFN－γ和IL－17A具有廣泛的生物學活性，在IBD中起到促進炎癥發生的作用［10］。TNF－α主要由活化的巨噬細胞和單核細胞分泌，在調節炎癥反應過程中發揮重要作用。TNF－α可誘導趨化因子，促使中性粒細胞遷移到腸道的炎癥區域，也可以釋放血小板活化因子，促進一氧化氮、白三烯釋放，并促進內皮細胞表達粘附分子，誘導血栓生成，引發腸黏膜血液循環障礙，進而導致腸道的黏膜組織廣泛性損傷［11］。IFN－γ是由NK細胞和T細胞產生的一種同二聚體糖蛋白，具有較強的免疫調節活性，能夠強有力的激活中性粒細胞和巨噬細胞，從而引起腸道炎癥反應［12］。Th17細胞亞群分泌的IL－17A可增加細胞滲透性，促進多種趨化因子和炎癥因子釋放，與其他炎癥因子一起發揮協同作用，放大其在IBD的致炎作用。而IL－4、IL－10以及Treg細胞起到抑制IBD發生的作用。Treg細胞有預防和減輕各種炎癥反應的作用，在介導免疫耐受中發揮重要作用［13］。IL－10又名細胞因子合成抑制因子，主要免疫調節作用是抑制激活的單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、T細胞發揮有效功能。IL－10是一種重要的細胞因子合成抑制因子在黏膜免疫中可抑制激活的單核細胞、巨噬細胞、T細胞、粒細胞發揮功能從而起到穩定腸道內環境的作用［14，15］。IL－4 則可通過抑制 Th1 細胞的增殖功能進而抑制腸道炎癥的發生［16］。在本研究中，不同濃度的DSS溶液誘導的IBD模型小鼠，各組炎癥因子表達存在明顯的劑量相關性，隨著DSS濃度的增加，促炎癥細胞因子表達增加而抗炎細胞因子的表達降低。本實驗的結果也為探索IBD中免疫因子的作用提供了寶貴線索。

綜上所述，本研究經濟高效地建立了DSS誘導的小鼠IBD模型，探討了DSS濃度與IBD致病相關免疫因子的相關性，相關研究結果為開展IBD發病機制研究以及尋找有效的IBD治療策略提供了有力工具。

［1］Engel MA，Neurath MF.New pathophysiological insights and modern treatment of IBD［J］.Gastroenterology，2010，45:571－583.

［2］孟松，吳文溪.炎癥性腸病的免疫治療進展［J］.醫學研究生學報，2010，23(9):972－976.

［3］張忠，程富勝，賈寧，等.小鼠潰瘍性結腸炎模型的建立及病理組織比較［J］.中國實驗動物學報，2012，20(6):69－72.

［4］Morris G P ，Beck PL，Herridge M S，et al.Hapten－induced model of chronic inflammation and ulceation in the rat colon［J］.Gastroenterology.1989，96:795－803

［5］Scheiffele F，Fuss IJ.Induction of TNBS colitis in mice［J］.Curr Protoc Immunol，2001，

［6］洪南，湛先保.腸道微生態系統和腸黏膜免疫關系研究進展［J］.醫學研究生學報2014.27(4):444－446.

［7］Ohkawara T，Nishihira J，Takeda H，et al.Amelioration of dextan sulfate sodium－induced colitis by anti－macrophage migration inhibitory factor antibody in mice［J］.Gastroenterology，2002，123(1):256－270.

［8］Oh SY，Cho KA，Kang JL，et al.Comparison of experimental mouse models of inflammatory bowel disease［J］.Int J Mol Med，2014，33:333－340.

［9］Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis［J］.Lab Invest.1993，69(2):238－249

［10］Abdel Salam AG，Ata HM，Salman TM，et al.Potential therapeutic utility of mesenchymal stem cells in inflammatory bowel disease in mice ［J］.Int Immunopharmacol，2014，22:515 －521.

［11］張曉文，蔣文瑜，于鵬麗，等.Th17細胞及其相關因子在活動性潰瘍性結腸炎患者中的表達及意義［J］.世界華人消化雜志，2013，21(1):19－26

［12］楊旭，沈洪，陸玥琳.Th17/Treg及其相關細胞因子失衡與潰瘍性結腸炎［J］.遼寧中醫藥大學學報，2014，16(10):93－95

［13］East L，Isacke CM.The mannose receptor family［J］.Biochim Biophys Acta，2002，157(2－3):364－386.

［14］Bamba S，Lee CY，Brittan M，et al.Bone marrow transplantation ameliorates pathology in interleukin－10 knockout colitic mice［J］.J Pathol 2006，209:265－273.

［15］Kim HS，Shin TH，Lee BC，et al.Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells reduce colitis in mice by activating NOD2 to COX2［J］.Gastroenterology.2013，145(6):1392－1403.

［16］Fischbeck A，Leucht K，Frey－Wagner I，et al.Sphingomyelin induces cathepsin D－mediated apoptosis in intestinal epithelial cells and increases inflammation in DSS colitis［J］.Gut 2011，60:55－65.