甘草酸脂質體的制備及小鼠體內肝靶向效率的評價

扈本荃，廉江平，徐玥，王燕，張韞，張博

(1.西安醫學院藥學院，西安 710021;2.陜西省人民醫院藥劑科，西安 710068)

肝炎是危害人類健康的嚴重疾病之一，尤其是慢性肝炎可誘發肝硬化、肝癌等繼發疾病，目前仍缺乏治愈率高、療效穩定的藥物。已有循證醫學證據表明，中草藥治療慢性乙型肝炎有潛在療效和明顯的經濟優勢［1，2］。

近代研究發現［2］，甘草酸有直接的抗乙肝病毒HBV作用及對肝功能障礙的改善作用，從甘草根中提取的甘草酸及其衍生物可明顯減輕肝細胞脂肪壞死以及肝細胞間質炎癥反應，抑制肝細胞纖維增生以及促進肝細胞再生等，是一種值得重視與推廣的慢性肝炎治療藥物。但因甘草酸難溶于水、生物利用度低、肝靶向性差等原因限制了甘草酸在臨床的實際應用。

脂質體是一種人工制備的攜有雙層包膜的磷脂質微囊，是一種定向給藥載體，經靜脈注射后，自然靶器官主要為肝臟，由此可提高局部藥物濃度并減少全身不良反應。本實驗以脂質體為載體，制備了甘草酸的肝靶向制劑，增加甘草酸在肝臟中的濃度，提高藥物的療效，增強了藥物的治療效果，減少不良反應的發生。本文采用RP－HPLC法測定了不同時間甘草酸在小鼠肝臟和血漿中的含量，以甘草酸注射劑為對照，以相對攝取率(re)、靶向效率(te)和峰濃度比(Ce)3個參數來評價脂質體的肝靶向性評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體重在18～22 g，購自第四軍醫大學實驗動物中心【SCXK(陜)2014 －002】，實驗前禁食 24 h，但自由進水，實驗于西安醫學院藥理實驗室進行【SYXK(陜)2010－002】，并按實驗動物使用3R原則給予人道關懷。

1.1.2 儀器和試劑

島津LC－10A高效液相色譜系統，SPD－10Avp紫外檢測器、Class－vp 6.0工作站(日本島津);真空干燥箱(SHZ北京科偉永鑫試驗儀器設備廠);150型超聲儀(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)，透射電子顯微鏡(JEM－2000EX，日本 Olympus公司)，GR－202型分析天平(十萬分之一，日本A＆D公司);旋轉蒸發儀(R201C上海申順生物科技有限公司)。

甘草酸標準品(北京恒元啟天化工技術研究院與北京世紀奧科生物技術有限公司聯合研制，含量:≥98%，批號:MUST－12103101);甘草酸原料藥(陜西惠科植物開發有限公司，含量≥98%，批號:20131101);大豆卵磷脂(天津市津南區咸水沽工業園區，含量≥99%，批號:Q/12HB4742－2012);膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司)、甘露醇(廣西南寧化學制藥有限責任公司，產品批號:F691A)。甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司);純水(雙重蒸餾水)、其余試劑為分析純;使用前所有液體試劑均經過0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.2 甘草酸脂質體的制備

精密稱取卵磷脂100 mg，膽固醇100 mg，置于500 mL茄形瓶中，再加入氯仿15 mL，使其充分溶解后，加入甘草酸10 mg，將燒瓶放在超聲清洗器上超聲3次，每次3min，待甘草酸完全溶解后，加入直徑為1 mm的玻璃珠20粒。37℃水浴下，以70 r/min旋轉減壓除去氯仿，可見在燒瓶內出現白色的半透膜，將燒瓶敞口放置，待氯仿完全揮發后置于真空干燥箱6～7 h，取出，加入6%甘露醇16 mL進行水合，超聲3次，每次20 min，得乳白色半透明液體，依次經過0.8 μm和0.45 μm 微孔濾膜過濾，分裝于適合的安瓿中，4℃條件下密閉避光保存。

1.3 甘草酸脂質體小鼠體內肝靶向性實驗

將小鼠隨機分為10組(其中實驗組5組，對照組5組)，每組6只，實驗組按12 mg/kg劑量小鼠尾靜脈注射甘草酸脂質體，對照組鼠尾靜脈注射同劑量的以生理鹽水和二甲基亞砜混合液(v/v，8∶2)配制相同濃度甘草酸的注射劑。

給藥后 5、30、60、120、240 min 眼眶取血0.5 mL置于肝素抗凝管中，3000 r/min，離心10 min，分取血漿，于－20℃保存，待檢。

取血后，小鼠眼眶取血后，立即取出肝臟，挑去膽囊，用蒸餾水洗滌去血，并用濾紙吸干表面水份，精密稱重后按2 μL/mg的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)勻漿，15000 r/min，離心 10 min，取肝漿(上清液)，－20℃保存，待檢.

1.4 RP-HPLC檢測小鼠肝臟和血中的甘草酸

1.4.1 生物樣本前處理

(1)血漿的前處理方法:取待測血漿100 μL，加入甲醇400 μL，用液體快速混合器渦旋2 min，離心(15000 r/min)10 min，取20 μL上清液進樣分析。

(2)肝漿的前處理方法:取肝漿液100 μL，加入甲醇400 μL，其后處理步驟同上述“血漿處理方法”。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:采用 Shim－pack VP－ODS色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－pH2.6 磷酸鹽緩沖液(69∶31);流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進樣量20 μL。在上述色譜條件下，樣品的分離良好，無內源性物質干擾，見圖1。

1.4.3 標準曲線的建立

取小鼠空白血漿及空白肝漿加入不同濃度甘草酸系列標準溶液，分別制成1.563 ～25 μg/mL甘草酸的血漿樣品和5～200 μg/mL甘草酸的肝漿樣品。按“1.4.1”項和“1.4.2”項條件對樣品處理并測定并按相關要求配制高、中、低三個濃度的模擬生物樣本進行方法學驗證［3］。

圖1 甘草酸測定的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of glycyrrhizic acid in the mouse plasma and liver

1.5 小鼠體內肝靶向性評價［4－8］

以各時間點藥物濃度均值繪制藥時曲線，以藥時曲線下面積(AUC)、血藥濃度(C)為定量指標，通過相對攝取率(re)、靶向效率(te)和峰濃度比(Ce)3個參數來衡量脂質體的組織靶向性。

式中AUClip表示脂質體組藥時曲線下面積，AUCinj表示注射劑組藥時曲線下面積;AUCliver，表示肝組織藥時曲線下面積，AUCplasma表示血漿藥時曲線下面積;(Cmax)lip表示脂質體組峰濃度，(Cmax)inj表示注射劑組峰濃度。re、Ce和 (te)靶向制劑/(te)非靶向制劑大于1時，藥物具有靶向性。

圖2 甘草酸脂質體透射電鏡照片(×100)Fig.2 Photograph of glycyrrhizic acid liposomes under transmission electron microscope

2 結果

2.1 甘草酸脂質體形態學、包封率及載藥量的檢測［9，10］

取適量脂質體采用磷鎢酸負染法于透射電鏡下檢測其形態，見圖2，制備得到的脂質體球形圓整，大小均勻，粒徑大小在40～60 nm之間;取適量甘草酸脂質體，通過透析技術分離未包封甘草酸，用RPHPLC法測定脂質體包封率及載藥量，甘草酸脂質體包封率為84%，載藥量為0.60 mg/mL;脂質體4℃放置2個月未發現任何沉淀，仍為乳白色混懸液，粒徑未見明顯變化，穩定性較好。

2.2 HPLC測定甘草酸的方法學驗證結果

以甘草酸峰面積 (Y)對模擬樣品濃度C(μg/mL)作線性回歸，血藥濃度組和肝藥濃度組回歸方程(n=5)分別為:Y=0.000808C+0.934432 r=0.9999;Y=0.000825C + 0.25003 r=0.9996。

二者r值表明在5～200 μg/mL和1.5625～25 μg/mL的范圍內線性關系良好。

2.2.1 精密度、回收率和穩定性結果

按1.4制備好的樣品在l d內反復進樣測定5次，測得日內精密度;每天進樣一次，連續測定5d，測得日間精密度，結果見表1、2，結果表明，精密度和回收率滿足要求。

2.2.2 穩定性結果

本試驗考察了高中低濃度的甘草酸經過血漿樣品和肝漿樣品處理后8 h內的穩定性，結果平均RSD為5.4%和3.6%，表明甘草酸過血漿樣品和肝漿樣品處理后在室溫條件下至少能穩定8 h。

表1 血液中甘草酸的方法回收率和精密度(n=5)Tab.1 Results of method recovery rate and precision of glycyrrhizic acid in plasma

表2 肝臟中甘草酸的方法回收率和精密度(n=3)Tab.2 Results of method recovery rate and precision of glycyrrhizic acid in the mouse liver

2.3 小鼠體內肝靶向性評價

靜注后小鼠肝臟內與小鼠血中藥物濃度進行t－檢驗分析，實驗組肝臟中的濃度明顯高于對照組(P＜0.05)，實驗組與對照組中血漿濃度無明顯差異(P＞0.05)，藥時－曲線見圖3、4。根據梯形法計算實驗組與對照組血漿和肝臟中的AUC。240 min內甘草酸脂質體在小鼠肝臟內的AUC為16.42 min/(μg·mL)，在血液中的 AUC 為 177.75 min/(μg·mL)，甘草酸注射劑在小鼠肝臟內的AUC為11.75 min/(μg·mL)，在血液中的 AUC 為 200.81 min/(μg·mL)。

圖3 血漿中甘草酸藥時曲線Fig.3 The plasma concentration－time curve of glycyrrhizic acid

240 min內甘草酸脂質體肝臟相對攝取率re=1.4(＞1)，表明脂質體制劑可明顯提高藥物在肝組織中的分布;甘草酸脂質體肝靶向效率te=0.092;甘草酸注射液te=0.059，脂質體組是注射劑組的1.6倍。肝臟中Ce=1.59(＞1)，血液中Ce=0.99。以上結果表明，與甘草酸注射劑相比，甘草酸脂質體有明顯的肝靶向性。

圖4 肝臟中甘草酸藥時曲線Fig.4 The liver concentration－time curve of glycyrrhizic acid in the mice

3 討論

小鼠體內甘草酸脂質體肝靶向評價參數相對攝取率re是脂質體組和溶液組在器官的AUC的比值，re＞1表示脂質體組在肝臟有靶向性，re值越大，靶向性越強;靶向效率(te)是指各器官的AUC與血漿AUC的比值，te表示待測物對靶器官的選擇性，te越大，選擇性越強。峰濃度比是指脂質體組和注射劑組在各組織的濃度C的比值，Ce表示脂質體改變藥物在肝臟中分布的效果，Ce大于1則具有靶向性，越大則表明改變藥物分布的效果越明顯。

本實驗測得甘草酸脂質體在小鼠內re為1.4，脂質體組te是注射劑組的1.6倍;肝臟中Ce=1.59(＞1)，血液中Ce=0.99，各結果均表明甘草酸脂質體有明顯的肝靶向性。

經小鼠靜脈注射甘草酸脂質體，小鼠肝臟的藥－時曲線并非是一條緩慢降低的平滑曲線，而是在實驗時間內有2個峰的曲線。形成這種現象的原因可能是甘草酸脂質體制備過程中，未將游離甘草酸分離，脂質體進入體內后游離甘草酸和脂質體包裹甘草酸共同發揮作用。游離甘草酸進入體內后隨血液循環進入肝臟，迅速形成濃度曲線上的第一個峰值，隨后肝臟中甘草酸濃度開始降低;隨后肝臟的吞噬細胞攝取脂質體，甘草酸脂質體在肝臟中富集并釋放藥物，形成濃度曲線上的第二個峰。

脂質體作為一種有效的被動靶向給藥系統，利用磷脂形成的脂質雙分子層囊泡包裹藥物分子，具有生物降解性和生物相容性，脂質體對肝臟有天然的靶向性。脂質體的被動靶向主要是網狀內皮系統的吞噬作用，大量研究表明，脂質體進入體內主要被網狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能。并改變被包封藥物的動力學性質和體內分布，使藥物主要分布在網狀內皮細胞富集的器官，達到減小給藥劑量。降低毒性的效果［11］。本實驗結果表明，與甘草酸注射液相比，脂質體顯著增加了甘草酸在肝的分布，甘草酸脂質體有明顯的肝靶向性。

RP－HPLC法測定血液及肝臟中甘草酸時，需要對血液和肝臟中的藥物進行提取，提取溶劑的選擇:筆者曾考察了三個提取方法:①先用氯仿提取揮干的殘渣，再以甲醇復溶;②飽和硫酸鋅甲醇溶液;③只用甲醇。但測定結果表明用①法甘草酸提取率太低，且引入內源性雜質太多;方法②和方法③提取效果相似，最終本實驗選擇了方法以甲醇為提取溶酶。血漿和甲醇(蛋白沉淀劑作用)的比例經多次實驗，確定1∶4為理想比例。

甘草酸為酸性三萜皂甙類化合物，考慮到生物體內的偏堿性環境可能使甘草酸成鹽(而變為離子態)，而影響到提取溶劑的效率。因此，曾擬用酸性緩沖液來作為小鼠肝臟的勻漿液，但實驗發現用酸性緩沖液作小鼠肝臟勻漿液，會引入過多的雜質，造成雜質峰過多而使主峰難以得到滿意的分離。最后，采用pH為7.4磷酸鹽緩沖液作為小鼠肝臟的勻漿液，引入的生物內源性雜質較少，甘草酸可以得到很好的分離。

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