黃芪多糖干預環磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能

張芮琪，陳正禮，羅啟慧

(四川農業大學動物醫學院，四川 雅安 625014)

近年來，健康養殖成為人們關注的問題，中草藥及其提取物因其來源廣泛、低毒及無耐藥性和無藥物殘留等優勢成為替代抗生素，治療和預防畜禽動物疾病的重要藥物。黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表，利尿拔毒，排膿和斂瘡生肌等功效［1］，為中醫臨床常用藥，有關其制劑及活性成分的藥理學研究一直受到重視。研究證實，其化學成分主要含有多糖、黃酮、多種皂苷以及生物堿、氨基酸和亞油酸等。其中，黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)作為黃芪的主要有效成分，在調節免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要作用［2］。近年來，黃芪多糖因其顯著的免疫增強和抗病毒效應，加上來源豐富、價格低廉、較低的毒性以及無耐藥性等［3］特性而廣泛應用于獸醫臨床、畜牧及水產動物的養殖中，其利用價值越來越受到重視。但目前在其對免疫抑制動物的研究上還沒有系統的綜合性評價指標與體系，因此本實驗就黃芪多糖對正常和免疫抑制小鼠免疫器官指數及其組織形態學的影響進行觀察，并從腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能和外周血T淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+和CD8+百分含量兩個方面研究黃芪多糖對正常小鼠及免疫抑制小鼠非特異性免疫及T淋巴細胞亞群的影響。一方面為其臨床應用提供理論依據，另一方面也可為多糖類物質免疫調控評價提供一套較為系統的評價指標體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

120只5周齡SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重(18±3)g，來源于成都達碩生物科技有限公司【SCXK(川)2013－24】。實驗在雅安普萊美生物科技有限公司【SYXK(川)2014－186】進行。在室溫22℃、控光條件下(14 h光照，10 h黑暗)按常規方式單籠飼養，在實驗室適應環境1周后用于實驗，并按實驗動物使用的原則給予人道的關懷。

1.1.2 主要儀器設備

流式細胞儀(Beckman Coulter Altra，美國Beckman公司);Motic數碼顯微照相系統(廈門麥克奧迪實業有限公司);Leica RM2235型輪轉切片機(德國徠卡儀器設備公司)，LS－100石蠟包埋機和GTK－2002自動恒溫攤烤烘片機(沈陽市龍首電子儀器有限公司)，Sartorius AA－160型電子讀數分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)，數顯恒溫水浴鍋HH－6型(國華電器有限公司)等。

1.1.3 主要試劑

黃芪多糖(購自陜西寶雞方晟生物開發有限公司)、環磷酰胺、FITC anti－mouse CD3+、PE antimouse CD4+、PE anti－mouse CD8+(均為美國 BD 公司產品)，肝素鈉(上海第一生化藥業有限公司)，蘇木素、伊紅、瑞特氏染液等。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

將小鼠隨機分為6組，每組20只:I組為對照組，II組為黃芪多糖低劑量組(100 mg/kg)、III為黃芪多糖高劑量組(500 mg/kg)、IV組為CTX免疫抑制模型組、V為CTX+黃芪多糖低劑量組、VI為CTX+黃芪多糖高劑量組。各組按相應劑量灌胃中藥多糖，連續灌胃14d。其中，第 IV、V、VI三組以CTX致免疫抑制小鼠模型為基礎［于灌服多糖的第1天腹腔注射75 mg/(kg·bw)CTX，隔1天注射1次，共3次］。

1.2.2 黃芪多糖對小鼠免疫器官指數及組織發育的影響

末次給藥后24 h，各組隨機取6只小鼠稱重，而后處死小鼠，取其脾臟及胸腺分別稱重，并計算胸腺和脾臟指數。稱重后的胸腺和脾臟組織均投入4%多聚甲醛中固定，按常規組織學方法制備石蠟切片，HE染色后進行組織病理學觀察。

1.2.3 黃芪多糖對小鼠非特異性免疫功能的影響

按照參考文獻［4］方法進行。主要操作如下:在末次給藥前三天每組隨機選6只小鼠腹腔注射6%淀粉溶液1 mL，末次給藥后30 min，每組小鼠腹腔注射2 mL的1%雞紅細胞懸液，30 min后腹腔注射2 mL PBS緩沖液，按揉腹部3～5 min。頸椎脫臼法處死小鼠，酒精消毒，吸取腹腔液，制作腹腔巨噬細胞涂片，姬姆薩染色，鏡下觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況。按以下公式計算吞噬百分率和吞噬指數。

吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬細胞數/計數的總巨噬細胞數 ×100%

吞噬指數:吞噬的雞紅細胞總數/計數的總巨噬細胞數 ×100%

1.2.4 黃芪多糖對免疫抑制模型小鼠外周血CD3+、CD4+和 CD8+的影響

末次給藥后2 h，每組隨機選6只小鼠。對各組小鼠實行摘除眼球法采血，1%肝素鈉抗凝。取200 μL抗凝血加入抗體20 μL，充分混勻，震蕩，室溫避光20 min;加600 μL紅細胞裂解液去除紅細胞，震蕩避光10 min;離心1500 r/min，5 min，棄上清，加PBS緩沖液1 mL洗，以去除未結合抗體;離心沉淀后棄上清;加300 μL 1%多聚甲醛固定液重懸，置于4℃冰箱，于24 h內流式細胞儀檢測。

1.2.5 數據分析

2 結果

2.1 黃芪多糖對小鼠免疫器官指數的影響

結果見表1。由表1可以看出，與對照組相比，高劑量APS可顯著提高正常小鼠脾臟的器官指數(P＜0.05)，高、低劑量的APS均可極顯著提高正常小鼠的胸腺指數(P＜0.01)。CTX模型組小鼠脾臟指數和胸腺指數均極顯著低于對照組，表明造模成功。與CTX模型組相比，低劑量APS可顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的脾臟指數和胸腺指數(P＜0.05)，而高劑量APS可極顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的脾臟指數和胸腺指數(P＜0.01)。

2.2 黃芪多糖對小鼠免疫器官組織發育的影響

2.2.1 黃芪多糖對小鼠脾臟組織結構的影響

對照組脾臟被膜較厚，并伸入實質形成小梁;脾臟實質由紅髓和白髓組成，其界限分明，白髓內淋巴細胞較為密集。與對照組相比(圖1A)，低、高劑量APS組脾臟白髓面積明顯增大，脾小結生發中心明顯，動脈周圍淋巴鞘增厚，白髓內淋巴細胞數量更多(圖1B、C)。CTX組脾臟組織結構雜亂，紅髓與白髓界限不清，白髓結構散亂，脾小結明顯變小，淋巴細胞較為稀疏(圖1D)。CTX+低劑量APS組，脾臟組織結構明顯改善，紅髓與白髓界限逐漸分明，白髓面積增大、淋巴細胞變得密集(圖1E);CTX+高劑量APS組脾臟組織形態恢復情況更好，動脈周圍淋巴鞘明顯增厚(圖1F)。

2.2.2 黃芪多糖對小鼠胸腺組織結構的影響

對照組胸腺小葉分界清楚，皮質與髓質界限清晰，皮質內淋巴細胞較為密集(圖2A)。與對照組相比，低、高劑量APS組的小鼠胸腺組織結構及小葉面積均有所增大，皮質變厚(圖2B、圖2C)。CTX模型組胸腺小葉結構不清，胸腺皮質萎縮、其中淋巴細胞變得稀疏，髓質區域明顯變大(圖2D)。CTX+低劑量APS組小鼠胸腺小葉結構較為清晰，皮髓質分界清楚，皮質增厚(圖2E)。CTX+高劑量APS組胸腺組織結構明顯好轉，皮質明顯增厚、其中淋巴細胞密集(圖2F)。

2.3 黃芪多糖對小鼠巨噬細胞功能的影響

如表1所示，與對照組相比，低、高劑量的APS均可顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(P＜0.05);與對照組比，CTX致免疫抑制模型組腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數均極顯著降低(P＜0.01)，而灌胃低、高劑量的APS均可顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的吞噬百分率及吞噬指數(P＜0.05)。

表1 黃芪多糖對小鼠免疫器官指數及巨噬細胞功能的影響()Tab.1 The effect of astragalus polysaccharide on the thymus，spleen and macrophage phagocytosis indexes in mice

表1 黃芪多糖對小鼠免疫器官指數及巨噬細胞功能的影響()Tab.1 The effect of astragalus polysaccharide on the thymus，spleen and macrophage phagocytosis indexes in mice

注:*表示與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05);＊＊表示與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01);△表示與環磷酰胺組相比差異有顯著性(P＜0.05);△△表示與環磷酰胺組相比差異有顯著性(P＜0.01)。Note.*P＜0.05 indicates significant and＊＊P＜0.01 indicates extremely significant differences compared with the control group.△P＜0.05 indicates significant and△△P＜0.01 indicates extremely significant differences compared with the CTX model group.

組別Immuneorgan index免疫器官指數/mg吞噬指數Phagocytic index對照組 Control 5.29±0.25 1.94±0.03 26.42±2.69 1.83±0.19黃芪多糖低劑量組 Low dose APS group 5.53±0.12 2.21±0.18＊＊ 30.79±3.16* 1.91±0.28*黃芪多糖高劑量組 High dose APS group 5.88±0.14* 2.26±0.12＊＊ 33.62±2.42* 1.98±0.22*環磷酰胺組 Model group induced by CTX 3.91±0.34＊＊ 1.42±0.17＊＊ 16.39±3.20＊＊ 1.25±0.16＊＊CTX+黃芪多糖低劑量組 CTX+low dose APS 4.41±0.26△ 1.57±0.25△ 21.86±2.15△ 1.59±0.31△CTX+黃芪多糖高劑量組 CTX+high dose APS 5.13±0.04△△ 1.76±0.04△△ 25.32±2.38△ 1.57±0.23 Groups巨噬細胞功能Macrophage phagocytosis脾臟指數Spleen index胸腺指數Thymus index吞噬百分率/%Phagocytic percentage△

注:A.空白對照組;B.黃芪多糖低劑量組;C.黃芪多糖高劑量組;D.CTX組;E.CTX+APS低劑量組;F.CTX+APS高劑量組。圖1 黃芪多糖對小鼠脾臟組織學結構的影響Note.A.Blank control group;B.Low dose APS group;C.High dose APS group;D.CTX group;E.CTX+low dose APS group;F.CTX+high dose APS groupFig.1 Effects of different doses of APS on histological structure of the mouse spleens

注:A.空白對照組;B.黃芪多糖低劑量組;C.黃芪多糖高劑量組;D.CTX組;E.CTX+APS低劑量組;F.CTX+APS高劑量組。圖2 黃芪多糖對小鼠胸腺組織學結構的影響Note.A.Blank control group;B.Low dosage APS group;C.High dosage APS group;D.CTX group;E.CTX+low dosage APS group;F.CTX+high dosage APS group.Fig.2 Effects of differerct doses of APS on histological structure of the mice spleens

2.4 黃芪多糖對免疫抑制小鼠T淋巴細胞亞群的影響

如表2所示，與對照組相比，低、高劑量的APS可不同程度地提高小鼠 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值、降低CD8+百分含量(P＜0.05或P＜0.01);而 CTX 組 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+明顯降低，說明造模成功。與CTX組相比，低、高劑量的APS均可顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)提高免疫抑制小鼠外周血血清中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值(P＜0.05或P＜0.01)，降低 CD8+百分含量。

表2 黃芪多糖對小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響(，%)Tab.2 Influence of PCP on T lymphocytes subsets in peripheral blood of the immunosuppressed mice

表2 黃芪多糖對小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響(，%)Tab.2 Influence of PCP on T lymphocytes subsets in peripheral blood of the immunosuppressed mice

注:*表示與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，＊＊表示與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01);△表示與環磷酰胺組相比差異有顯著性(P＜0.05)，△△表示與環磷酰胺組相比差異有顯著性(P＜0.01)。Note.*Difference is significant(P＜ 0.05)and＊＊difference is extremely significant(P＜ 0.01)in comparison with the control;△Difference is significant(P＜0.05)and△△difference is extremely significant(P＜0.01)compared with CTX model group.

組別 Groups CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+對照組 Control 32.16±1.91 26.24±0.92 16.75±1.71 1.53±0.21黃芪多糖低劑量組 APS 1group 34.91±3.02* 28.01±1.98* 14.87±1.59* 1.92±0.43*黃芪多糖高劑量組 APS 2 group 35.27±2.76* 29.12±2.14* 13.24±0.91＊＊ 2.32±0.25＊＊環磷酰胺模型組The model group 20.36±2.13＊＊ 17.53±1.21＊＊ 21.23±1.47＊＊ 1.07±0.13＊＊CTX+PCP中濃度CTX+APS1 27.52±1.87△ 21.28±3.15△ 19.52±0.79△ 1.38±0.14 CTX+黃芪多糖組CTX+APS2 30.89±3.71△△ 23.75±1.87△ 17.92±1.28△△ 1.47±0.23△

3 討論

3.1 黃芪多糖對正常和CTX誘導免疫抑制小鼠脾臟和胸腺發育的影響

脾臟、胸腺指數在一定程度上能反應出免疫器官的發育程度，可以直觀的體現出機體免疫功能的強弱。較多研究結果已經證實，植物多糖作為免疫調節劑能夠促進免疫器官的發育成熟，延緩胸腺退化。Liu等［5］的研究證實，雞爪大黃多糖可以明顯提高輻射誘導免疫損傷小鼠的脾臟和胸腺指數、碳廓清率、巨噬細胞吞噬活性、淋巴細胞增值率及血清溶血素值及NK活性，提示雞爪大黃多糖對輻射誘導的小鼠免疫損傷具有保護作用。衰老小鼠給以白術多糖提取物后其胸腺、脾臟和心臟指數均顯著增加，提示白術多糖提取物可能增強衰老小鼠的免疫并促進其心臟功能［6］。雞樅菌多糖能明顯拮抗CTX的細胞毒作用，促進淋巴細胞增殖，提高免疫抑制小鼠的脾臟和胸腺重量及器官指數，對免疫器官有明顯保護作用［7］。150 mg/kg黃芪多糖灌胃小鼠7d可顯著小鼠胸腺和脾臟重量［8］。本實驗結果表明，低、高劑量的APS均可顯著提高正常小鼠及免疫抑制小鼠的脾臟及胸腺器官指數，表明PCP可以促進小鼠免疫器官的生長發育，對環磷酰胺致免疫功能障礙有一定的改善，且其促進作用與劑量呈正相關。

免疫器官的組織發育程度也直接影響到其生理功能，較多的研究已經證實，某些中藥成分可以在一定程度上促進動物免疫器官的組織發育。周金星等［9］研究了不同劑量黨參和淫羊藿提取物對青腳麻雞脾臟組織結構的影響，結果表明飲水中添加黨參和淫羊藿提取物均可促進青腳麻雞脾臟的組織發育。喬恩美等［10］的研究結果顯示，基礎日糧中添加20和40 mg/kg低聚殼聚糖能明顯促進肉雞的生長性能及免疫器官的組織發育，增強機體的免疫功能。本實驗結果表明，低、高劑量APS組小鼠脾臟白髓面積增大，脾小結生發中心明顯，動脈周圍淋巴鞘增厚;胸腺小葉體積增大，皮質變厚，高劑量PCP組效果更為明顯。CTX致免疫抑制小鼠在灌服不同劑量的APS后，脾臟及胸腺組織形態均有所改善，提示APS可以拮抗CTX引起的小鼠脾臟和胸腺發育損傷，提高免疫抑制小鼠脾臟及胸腺的免疫功能。

3.2 黃芪多糖對腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調節等重要作用。因而，激活巨噬細胞可提高機體抗腫瘤和抗感染能力［11］。腹腔巨噬細胞的吞噬功能還是機體非特異性免疫應答的重要組成部分。已經證實，植物多糖可激活巨噬細胞，提高其吞噬功能。如馬齒覓多糖可顯著提高巨噬細胞的吞噬功能，增加吞噬百分率和吞噬指數，促進淋巴細胞的轉化［12］。曾星等［13］用流式細胞術研究了豬苓多糖對模型大鼠巨噬細胞吞噬率的影響，結果表明，豬苓多糖可顯著促進膀胱癌大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能和表面免疫相關分子的表達。本實驗結果表明，與對照組相比，CTX組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數均顯著降低，低、高劑量APS組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數與對照組相比均顯著升高。添加低、高劑量的APS均顯著提高了免疫抑制小鼠的巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數，說明APS在一定程度上可促進小鼠的非特異性免疫功能。

3.3 黃芪多糖對免疫抑制小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

T淋巴細胞的表面標志有兩大類:一類為T淋巴細胞所共有的CD3+標志，另一類為亞群特有標志，CD4+為輔助/誘導功能細胞，CD8+為抑制/殺傷功能細胞。有研究證實，T淋巴細胞對體內一切體液和細胞免疫反應類型和強度都有調節作用，其中主要的是CD3、CD4、CD8細胞亞群。CD3+亞群是成熟的T淋巴細胞，其比值降低提示機體細胞免疫功能減弱，機體易發生感染;CD4+亞群是調節機體免疫功能最重要的樞紐細胞，其值降低會引起機體免疫功能低下;CD8+亞群為免疫反應中的直接殺傷性細胞，其值增高可導致免疫缺陷;CD4+/CD8+比值，判斷機體免疫功能紊亂的臨床診斷敏感指標，其值降低提示機體處于“免疫抑制”狀態［14］。有研究［15－16］證實，黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)、板藍根多糖(isatis root polysaccharide，IRPS)、牛膝多糖(achyranthes root polysaccharide，ARPS)和山藥多糖(Chinese yam polysaccharide，CYPS)均能顯著提高免疫雛雞的新城疫HI抗體效價，促進外周血T淋巴細胞增殖，并可提高CD4+、CD8+T淋巴細胞含量和CD4+/CD8+值。本實驗結果顯示，中、高劑量的APS均可不同程度提高正常及免疫抑制小鼠外周血血清中 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值(P＜0.05或P＜0.01)，而降低CD8+百分含量，提示黃芪多糖可以明顯促進免疫抑制小鼠的T淋巴細胞增殖，增強機體的細胞免疫，從而改善機體的免疫功能低下狀態。

3.4 黃芪多糖干預小鼠免疫功能評價體系的建立

結合本文與已有文獻報道可以看出黃芪多糖干預正常小鼠和免疫抑制小鼠后，其相應的免疫器官指數、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能和外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD8+百分含量等均呈現了顯著性的變化，且與其他多糖的免疫調控機制有相似之處，闡明了黃芪多糖的免疫調控作用機制。因此，從本文研究指標的敏感性變化規律看，本文研究結果與評價體系可以作為評價多糖類類物質對機體免疫調控的的參考標準與指導。

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