酸吸入性肺損傷小鼠模型的建立

郭磊，劉龍丁* ，梅俊杰，2*

(1.中國醫學科學院醫學生物學研究所，昆明 650118;2.費城兒童醫院，美國 費城 19104)

全球每年大約有100萬急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的患者發展成為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，其死亡率可達到30% ～50%［1］。急性肺損傷的誘因有很多，包括創傷、吸入性損傷、胃酸反流入肺、細菌或呼吸道病毒感染等。在這當中，約11%的臨床急性肺損傷患者是由于胃酸反流入肺引起［2］。胃酸反流入肺后，酸性消化液破壞肺泡－毛細血管結構，血液中的白細胞大量浸潤入肺泡，形成嚴重的肺部免疫炎癥反應，導致肺水腫和低氧性呼吸功能不全。鹽酸灌注小鼠肺部的肺損傷模型能夠很好模擬臨床胃酸反流入肺的癥狀，引起典型的肺部嚴重免疫炎癥反應和肺水腫，是當前研究酸吸入性肺損傷常用的實驗模型［3］。

小鼠酸吸入性肺損傷模型的建立需要對小鼠氣管進行切口后插管，從而灌流一定濃度的鹽酸入肺。該方法對小鼠氣管和肺泡均造成損傷，嚴重時即使術后給予呼吸機輔助呼吸小鼠，小鼠也只能存活2～3 h，從而無法對酸吸入肺損傷及修復過程進行長期研究［4］。Das等［5］開發了一種可視小鼠氣管插管的實驗技術，該技術利用光纖光源介導從小鼠口腔進行氣管插管，插管后可直接從小鼠口部灌流入小鼠的氣管和肺部，無創傷性，術后小鼠死亡率顯著降低［5］。為了建立一個對酸吸入肺損傷及修復過程進行研究的小鼠模型，本研究利用口腔氣管插管的方法，將鹽酸導入小鼠右側肺部，在提高小鼠術后存活率的同時可以對小鼠肺損傷及修復過程免疫機理進行長期研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

SPF級C57BL/6小鼠，8～10周齡，雌性，體重22～25 g。由中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗動物中心提供【SCXK(滇)2010－0003】，相關動物實驗均在中國醫學科學院醫學生物學研究所SPF級動物實驗室進行無菌操作【SYXK(滇)2010－0007】。小鼠隨機分為氣管插管鹽酸實驗組和氣管插管生理鹽水對照組，各組小鼠分配如下:小鼠存活率檢測使用15只、肺功能分析6只、肺盥洗液炎性因子檢測6只、病理學檢查3只，兩組共計使用60只小鼠。分析純鹽酸(HCL)購自重慶川東化工集團有限公司，工作濃度為0.9%生理鹽水稀釋至0.1 mol/L(pH 1.5)。靜脈套管(規格20)購自美國BD公司。0.5 mm光纖購自美國Edmund Optics公司。光源盒(型號NCL－150)購自美國Volpi公司。小鼠脈搏血氧儀MouseOx購自美國Starr公司。小鼠肺功能儀flexiVent購自美國Scireq公司。小鼠細胞因子 TNF－α (MTA00B)、IL－6(M6000B)、MIP－2(DY452)和KC(MKC00B)ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D Systems公司。

1.2 口腔氣管插管鹽酸灌流小鼠模型建立

口腔氣管插管方法按照 Das等［5］可視插管技術改進而來。具體來說，無菌插管(靜脈套管)套在光纖末端，光纖另一端接通光源。ketamine(125 μg/g)和xylazine(12.5 μg/g)腹腔注射麻醉后的小鼠，通過門牙固定垂直掛立在操作平臺上。隨后用手溫和的將其舌頭拉出，暴露出口腔及氣管開口。利用光纖光源的引導，將插管由上至下小心插入氣管，隨后緩慢抽出光纖而插管留置在小鼠氣管內。進入氣管的插管連接5 mL注射器，輕緩抽吸，通過觀察小鼠胸腔擴張確定插管準確插入小鼠氣管。

鹽酸(HCL)灌流:插管后的小鼠放置為45°右側臥體位，配合手指按壓其胸腔左側肺部，用1 mL注射器將0.1 mol/L pH 1.5的HCL(按2.5 μL/g重量給劑量)連接插管后緩緩推入小鼠氣管和肺部。注射后保持小鼠側臥體位1 mim，盡量使酸液流入小鼠右側肺葉。

鹽酸灌流后的小鼠放入小型恒溫觀察室，并給予供氧4 h直至麻醉消退。小鼠在鹽酸灌流后的1～3 d極其虛弱，取食困難，按每只0.8 mL/d腹腔注射給予D－(+)－吡喃葡萄糖營養液。

1.3 肺損傷小鼠生理指標檢測

1.3.1 肺功能檢測

(1)肺濕干重比:酸吸入后24 h，斷頸處死小鼠開胸取其肺組織稱濕重，隨后用電熱恒溫干燥箱60℃下烘干，24 h后稱干重，計算肺濕/干重比。

(2)肺回彈性:麻醉后小鼠進行氣管插管，插管后將其套管連接到flexiVent肺功能儀上進行監測(術后1～8 d)，記錄肺回彈性指標并進行統計學處理。

(3)動脈血氧飽和度:利用無創體外MouseOx脈搏血氧儀系統，在小鼠頸部放置電極以獲得動脈血氧飽和度數值，各實驗組(n=6)數據進行統計學處理。

1.3.2 肺部病理檢測

小鼠肺組織(酸吸入后24 h)用4%多聚甲醛充盈后浸泡于多聚甲醛中固定，48 h后進行石蠟包埋、切片(冠狀切5 μm厚度)。蘇木素－伊紅(H＆E)染色，光鏡下觀察肺組織形態學改變。

1.3.3 肺盥洗液白細胞計數及細胞因子檢測

肺泡盥洗液:術后24 h對小鼠氣管進行插管并結扎固定，隨之用0.8 mL無菌生理鹽水沖洗肺部5次，收集盥洗液置于4℃保存。肺盥洗液細胞計數:肺盥洗液用ACK buffer裂解紅細胞后利用細胞計數板對白細胞計數。隨后cytospin對肺盥洗液細胞進行涂片離心，Diff－Quick染色法細胞染色后計數白細胞中巨噬細胞和嗜中性粒細胞的數量。細胞因子檢測:肺盥洗液細胞離心后(1500 g，3 min)取上清進行 ELISA 測定細胞因子 TNF－α、IL－6、MIP－2 和 KC的含量。蛋白濃度測定:肺盥洗液離心上清利用BCA法測定總蛋白含量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 鹽酸灌流鼠肺模型的建立

注:a:亞甲基藍灌流小鼠肺葉;b:鹽酸灌流小鼠術后存活率(生理鹽水對照組、氣管切口鹽酸組和光纖介導鹽酸組，n=15);c:組織學檢查鹽酸和生理鹽水灌流鼠肺(H＆E染色，×20/×400)圖1 鹽酸灌流小鼠肺部模型的建立Note:a:Methylene blue instillation of a mouse lung;b:Survival of acid instillation mice(saline control group，tracheostomy group and fiber－optic guidance group，n=15);c:Histological examination of HCl and saline instillation mouse lung(H＆E staining，×20/×400)Fig.1 Establish of HCl instillation mouse lung injury model

為了減少手術對小鼠的傷害，降低術后死亡率，實驗一方面采用無創傷口腔插管技術對小鼠氣管進行插管，另一方面利用重力作用和擠壓左肺的方法將鹽酸主要導入小鼠右肺肺葉，以減少小鼠肺負擔。亞甲基藍染料模擬鹽酸灌流小鼠肺部顯示，染料大部分流入到了小鼠右側肺部，將右側肺葉染成藍色(圖1a)。對術后小鼠存活率的分析表明，利用實驗所采用的鹽酸灌流方法，其存活率達到約80%，顯著高于常規氣管切口插管鹽酸灌流小鼠的存活率(圖1b)。酸吸入后肺組織切片檢查揭示(圖1c)，與對照生理鹽水吸入小鼠相比，酸吸入后導致小鼠肺泡結構瓦解，透明膜形成，肺泡間質腫脹，富含蛋白的液體進入肺泡腔，形成肺水腫。此外，肺葉出血，免疫炎性細胞侵潤入肺泡并聚集在間質空間，造成局部炎癥反應。上述結果表明，在保證肺損傷建立的前提下，實驗所采用的鹽酸灌流方法極大提高了小鼠的術后存活率。

2.2 肺功能分析

對肺的濕重與干重比指標的分析發現，酸吸入后24 h，小鼠濕干重比與對照組相比明顯增加(圖2a)，表明酸吸入后導致小鼠肺部出現肺水腫。對術后小鼠肺功能的連續監測發現，酸吸入后小鼠肺回彈性激增(圖2b)，揭示肺水腫的形成導致肺回彈阻力增大，肺收縮功能受到影響。隨著時間的推移肺回彈性逐漸回落，揭示急性肺損傷的一個恢復過程。肺功能的削弱也直接導致小鼠動脈氧含量的降低，從術后小鼠動脈血氧飽和度的分析來看，術后第一天氧飽和度下降至75%左右，隨著肺損傷的恢復氧飽和度逐漸回升，到術后第9天接近于90%(圖2c)。通過上述肺功能指標的分析表明，鹽酸的吸入導致小鼠肺部肺水腫及肺功能受損，術后一周后逐漸恢復。

2.3 肺部炎癥反應分析

酸吸入導致肺泡結構遭到破壞，病理切片可見炎性細胞浸潤入肺泡造成急性肺部免疫炎癥反應(圖1c)。對肺泡盥洗液中的白細胞計數表明酸吸入后大量白細胞進入到肺泡內(圖3a)。進一步對肺泡內白細胞染色后計數發現，進入肺泡中的免疫細胞主要為嗜中性粒細胞(圖3a)，大量的嗜中性粒細胞引發了肺部炎癥反應。對肺泡盥洗液中的蛋白含量及細胞因子檢測發現，酸吸入后導致肺泡液總蛋白含量升高(圖3b)，其中ELISA檢測表明，肺泡液中 TNF－α、IL－6、KC(CXCL－1)和 MIP－2(CXCL－2)等細胞免疫炎癥因子含量均顯著升高(圖3b)。上述結果證實了酸吸入所致小鼠肺部嚴重的免疫炎癥反應。

注:a:鹽酸和生理鹽水灌流小鼠肺濕/干重比(mean±SD，n=6);b:鹽酸灌流小鼠術后肺回彈性(mean±SD，n=6);c:鹽酸灌流小鼠術后動脈血氧飽和度(mean±SD，n=6)。圖2 鹽酸灌流小鼠肺生理指標監測Note.a:Wet/dry ratio of mouse lung after HCl or saline instillation(mean±SD，n=6);b:Lung elastance after HCl instillation(mean±SD，n=6);c:Arterial oxygen saturation after HCl instillation(mean±SD，n=6).Fig.2 Monitoring of lung function in the mice after HCl instillation

注:A:小鼠肺盥洗液白細胞(圖左)和嗜中性粒細胞計數(圖右)(mean±SD，n=6);B:小鼠肺盥洗液總蛋白含量及TNF－α、IL－6、KC和MIP－2 含量測定(mean±SD，n=6)。圖3 小鼠肺盥洗液分析Note.A:Counting of leukocytes and neutrophils in BALF(mean ±SD，n=6);B:Quantitation of BALF total proteins and cytokines(TNF－α，IL－6，KC，MIP－2)(mean ± SD，n=6).Fig.3 Analysis of the mouse bronchoalveolar lavage fluid(BALF)

3 討論

酸性物質誤吸入肺導致肺損傷多見于手術后麻醉恢復過程和重癥監護意識不清醒的病人胃消化液反流入肺，引發肺炎及呼吸功能抑制，是術后高風險并發癥之一［6－8］。胃消化液中的低pH胃酸是對肺泡上皮細胞的主要傷害，鹽酸作為胃酸的主要成分，進入肺泡后破壞肺泡上皮細胞并損傷血管內皮細胞，導致炎性細胞侵潤入肺部致炎癥反應，肺功能受損［9－11］。利用鹽酸灌流鼠肺能夠很好模擬胃酸反流入肺引發的炎癥損傷和肺功能不全［9，12］，是目前研究酸所致肺損傷的動物模型。

酸吸入小鼠模型的建立通常采用氣管插管后灌流一定濃度的低pH的鹽酸(通常為1.5)進入小鼠肺部［3，4，13－16］。灌流鹽酸濃度既需要能夠引起炎癥損傷又要防止體積或濃度過大導致小鼠死亡。實驗過程中需要對小鼠氣管進行切口后插管，術后縫合。由于氣管處創傷的存在導致術后長期觀測過程中傷口易感染，傷口引發的炎癥反應也會對小鼠肺部炎癥損傷的評估有一定干擾。我們采用一種可視化無創傷的口腔氣管插管技術［5］對小鼠進行插管，同時灌流時改變小鼠的體位使鹽酸經氣管主要進入到小鼠右側肺葉中，保證小鼠左肺功能運轉。我們的結果表明，采取這樣的手段有效降低了手術的風險，提高了術后小鼠的存活率。此外，運用這樣的建模方法可以最大限度提高灌流鹽酸的體積和濃度達到2.5 μL/g 0.1 mol/L。在該濃度條件下，病理檢測和肺功能分析表明小鼠右肺出現典型免疫炎癥反應和肺損傷。

急性肺損傷主要是一個免疫損傷的過程，肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞凋亡或壞死，導致肺泡－毛細血管屏障打破，肺泡基底膜通透性增加，大量嗜中性粒細胞從毛細血管進入到肺泡中。破損的I型和II型肺泡上皮細胞釋放細胞炎性因子諸如IL－1、6、8 和 TNF－α，激活嗜中性粒細胞和巨噬細胞誘發免疫炎癥反應［17－20］。我們從肺損傷小鼠肺盥洗液中檢測到了大量白細胞，包含巨噬細胞和嗜中性粒細胞，其中嗜中性粒細胞的比例顯著增加，表明嗜中性粒細胞在肺部炎癥反應中的一個主要作用。此外，在肺盥洗液中還檢測到不同濃度的TNF－α、IL－6 和趨化因子 CXCL－1(KC)、CXCL－2(MIP－2)等炎性因子，這些因子均為嗜中性粒細胞的效應分子，進一步證明嗜中性粒細胞在肺炎性損傷中的重要作用。

單純利用鹽酸灌流并不能全面反映酸性消化液混雜消化后食物殘渣及細菌物質的胃酸反流入肺的情況，然而采用胃消化液進行肺灌流需要對胃消化物進行高壓過濾無菌處理后灌流［21－23］，滅活后的胃消化液主要刺激成分仍為鹽酸。鹽酸吸入肺損傷小鼠模型很好反映了肺損傷后肺部免疫炎癥進程，我們建立的模型表明嗜中性粒細胞在肺炎性損傷中的重要作用，為進一步研究肺部免疫炎癥機理提供了平臺。

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