葡萄糖酸鈣對間斑寇蛛毒液致痛大鼠脊髓致痛因子表達的影響

劉娟娟，董新玲，寇曉文，孫輝(新疆醫科大學第二附屬醫院急救中心，烏魯木齊830063)

葡萄糖酸鈣對間斑寇蛛毒液致痛大鼠脊髓致痛因子表達的影響

劉娟娟，董新玲，寇曉文，孫輝
(新疆醫科大學第二附屬醫院急救中心，烏魯木齊830063)

目的探討葡萄糖酸鈣對間斑寇蛛毒液致痛大鼠脊髓中致痛因子依賴于鈣離子的鉀離子通道蛋白(IK1)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、環氧合酶2(COX-2)、嘌呤能受體(P2X3)相對表達量的影響，研究葡萄糖酸鈣在疼痛中的作用。方法將雄性SD大鼠80只隨機分為福爾馬林、10、40、100、300μL/kg毒液致痛組(40只)和鈣劑治療組(40只)，其中治療組大鼠預先尾部靜脈注射10%葡萄糖酸鈣2mL，然后兩組大鼠均以5%福爾馬林溶液150μL和4種劑量(10、40、100、300μL/kg)的間斑寇蛛毒液進行足底皮下注射，24 h后處死后，取L4～5脊髓標本，采用免疫組化、Western blot和熒光實時定量PCR技術分別從組織學、蛋白以及分子水平分析兩組P2X3、CGRP、COX-2和IK1相對表達量。結果(1)免疫組化結果顯示300μL/kg毒液劑量時，治療組P2X3和CGRP的表達顯著低于致痛組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，COX-2和IK1的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。(2) Western blotting結果顯示，與致痛組各劑量相比，10μL/kg劑量治療組大鼠脊髓中P2X3和IK1表達量明顯升高，CGRP和COX-2表達量降低，差異有統計學意義(P＜0.05);40μL/kg劑量治療組COX-2表達量降低，CGRP、P2X3和IK1的表達差異無統計學意義(P＞0.05);100μL/kg劑量治療組P2X3、CGRP和IK1表達量明顯降低，COX-2的表達量升高，差異具有統計學意義(P＜0.05);300μL/kg劑量治療組大鼠脊髓中P2X3、CGRP、COX-2、IK1表達量明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。(3)熒光實時定量PCR結果顯示:10μL/kg治療組大鼠脊髓中P2X3和CGRPmRNA的表達高于致痛組，COX-2和IK1mRNA的表達低于致痛組，差異有統計學意義(P＜0.05);40μL/ kg治療組P2X3和IK1mRNA的表達高于致痛組，CGRP mRNA的表達低于致痛組，差異有統計學意義(P＜0.05)，COX-2mRNA的表達差異無統計學意義(P＞0.05);100μL/kg治療組P2X3、CGRP、和COX-2mRNA的表達均高于致痛組，IK1mRNA的表達低于致痛組，差異有統計學意義(P＜0.05);300μL/kg治療組P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA的表達均高于致痛組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。各致痛組間P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)。(4)3種方法結果顯示福爾馬林致痛組與治療組致痛因子的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。結論新疆間斑寇蛛毒的致痛機制可能與大鼠脊髓中致痛因子CGRP、P2X3、COX-2和IK1蛋白的高表達有關，葡萄糖酸鈣能顯著抑制部分高濃度毒素組致痛因子CGRP、P2X3、COX-2和IK1蛋白的表達量，緩解疼痛的傳遞。

葡萄糖酸鈣;間斑寇蛛毒;致痛因子;抑制作用

新疆是世界范圍內發生間斑寇蛛(俗稱“黑寡婦”)咬傷人畜最多、程度最嚴重的地區之一［1］。被間斑寇蛛咬傷患者均有劇烈腹部乃至全身疼痛，臨床觀察發現給患者靜脈注射葡萄糖酸鈣制劑能有效緩解疼痛。有研究表明，間斑寇蛛毒液可能參與激活Ca2+相關的離子通道，而這種離子通道的變化引起動作電位改變，激活感受器，將痛覺產生的傳入沖動經脊髓背角整合傳遞到大腦高級中樞加工后，最終產生痛覺［2］。因此，對致痛因子依賴于鈣離子的鉀離子通道蛋白(IK1)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、環氧合酶-2(COX-2)、嘌呤能受體(P2X3)的研究至關重要。目前，間斑寇蛛毒液對致痛因子IK1、CGRP、COX-2、P2X3表達量的影響及葡萄糖酸鈣緩解疼痛的機制尚未見報道。本研究在間斑寇蛛毒致大鼠疼痛模型的建立及葡萄糖酸鈣對其作用研究的基礎上［3］，從組織學、蛋白及分子水平觀察間斑寇蛛毒液對大鼠脊髓中致痛因子CGRP、COX-2、P2X3和IK1表達量的影響，探討葡萄糖酸鈣緩解間斑寇蛛毒致痛作用的機制。

1 對象與方法

1.1 間斑寇蛛粗毒液的準備及成分分析采集間斑寇蛛后，利用活體取毒囊采毒法取毒［4］。本課題組將所提取的新疆間斑寇蛛粗毒液送至湖南師范大學生命科學學院生物教研室，進行理化和生物學性質的分析。定量測定結果表明，粗毒的蛋白質含量為36.99%，對小鼠和蜚蠊的LD50分別為0.39 mg/kg和2.32μg/g［5］。

1.2 實驗動物及分組80只雄性SD大鼠，均購自新疆醫科大學實驗動物中心。體質量160～210 g，SPF級，飼料經過Co60照射，水經過滅菌處理，大鼠在安靜環境中飼養1 d后，按體重分層隨機抽樣分為福爾馬林致痛組、10、40、100、300μL/kg毒液致痛組(A1、B1、C1、D1和E1組)和A2、B2、C2、D2治療組，治療組大鼠均采用尾部靜脈注射的方式緩慢注射10%葡萄糖酸鈣制劑2 mL，注射結束后，治療組與致痛組每只大鼠均于右足底皮下注射5%福爾馬林溶液150μL和間斑寇蛛毒液10、40、100、300μL/kg，各劑量組各8只大鼠。

1.3 免疫組織化學法實驗大鼠注射間斑寇蛛毒素24 h后斷頸處死，取脊髓L4～5標本，中性福爾馬林固定，并進行脫水、包埋、切片等步驟，按照最佳稀釋比例分別稀釋兔抗P2X3多克隆抗體(1∶500)、兔抗CGRP單克隆抗體(1∶50)、小鼠抗COX2單克隆抗體(1∶200)、小鼠抗IK1單克隆抗體(1∶50)(美國ABCAM和美國santa cruz公司提供)，上樣量均為50μL，按SP法免疫組化試劑盒操作步驟進行染色操作(北京中衫金橋生物有限公司)，脊髓后角神經元中棕色顆粒為染色陽性，400倍視野選擇P2X3、CGRP、COX2、IK1陽性表達部位，每張切片找出3個黏膜層陽性表達部位并采集照片。

1.4 Western blot法L4～5脊髓樣本，研磨后13 000 r/min離心15min，吸取上清液為組織蛋白溶液，置于液氮中保存。BCA法測定蛋白濃度，然后按照Western blotting實驗步驟處理組織蛋白溶液，一抗為兔抗P2X3多克隆抗體、兔抗CGRP單克隆抗體、小鼠抗COX2單克隆抗體、小鼠抗IK1單克隆抗體和小鼠抗beta-actin單克隆抗體(前兩者由美國ABCAM公司提供，其余由美國santa cruz公司提供)，二抗為兔抗小鼠HPR標記二抗和兔抗山羊HRP標記二抗(美國Thermo scientific公司提供)，上樣量預染蛋白marker 5μL，樣品蛋白每孔加上樣緩沖液補足20μL。顯色后用ChemiScope 3000化學發光儀檢測、拍照，使用軟件分析處理，用Imageproplus(version 4.1)軟件計算目的蛋白的灰度值，并與beta-actin比較，計算目的蛋白的表達豐度。

1.5 熒光定量PCR技術L4～5脊髓樣本，置于液氮中保存，研磨后用Trizol試劑(美國invitrgen公司)提取RNA，采用M-MuLV逆轉錄試劑盒(美國MBI公司)合成cDNA。Real-time PCR反應總體積為20μL，含cDNA 1μL，引物0.8μL(10μM)，SYBR Select Master Mix 10μL，補雙蒸水8.2μl，在ABI 7500型實時定量PCR上檢測(試劑盒及儀器均購自美國ABI公司)。反應程序設置為UDG Activation 50℃2 min，AmpliTag UP Activation 95℃2 min，Denature 95℃15 s，Extend 60℃1 min，共40個循環。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，各因子表達量的計算，采用2-ΔΔCt法，ΔCt= Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt治療組樣品-ΔCt致痛組樣品，相對表達量=2-ΔΔCt。

1.6 統計學處理使用SPSS17.0統計軟件包對數據進行處理，免疫組化結果做定性分析，Western blotting各項指標采用完全隨機設計的兩樣本單因素方差分析，實時定量PCR技術以引物β-actin為內對照，分析圖片中P2X3、COX2、CGRP、SP及βactin表達強度，計算二者的相對系數，各項指標以均值±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，致痛組間P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA表達經單因素方差分析，上述分析均采用雙側檢驗，檢驗水準ɑ=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化結果福爾馬林治療組P2X3、CGRP、COX-2和IK1的表達低于致痛組，差異無統計學意義(P＞0.05)。治療組與致痛組相比，P2X3和CGRP的表達差異具有統計學意義(P＜0.05); COX-2和IK1的表達差異無統計學意義(P＞0.05);COX-2在所有的實驗大鼠脊髓背角神經元、神經膠質細胞的表達均為陰性，在血管內皮細胞的表達為陽性，見圖1。

2.2 W estern blot實驗結果福爾馬林治療組COX-2的表達明顯低于致痛組，P2X3、CGRP和IK1的表達差異無統計學意義(P＞0.05);與致痛組相比，10μL/kg劑量治療組P2X3和IK1的表達升高，CGRP和COX-2表達降低，差異有統計學意義(P＜0.05);與致痛組相比，40μL/kg劑量組治療組COX-2的表達降低，CGRP、P2X3和IK1的表達差異無統計學意義(P＞0.05);與致痛組相比，100μL/ kg劑量治療組P2X3、CGRP和IK1蛋白表達量明顯降低，COX-2的表達量升高，差異具有統計學意義(P＜0.05);與致痛組相比，300μL/kg劑量治療組大鼠脊髓中P2X3、CGRP、COX-2和IK1的蛋白表達量明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2、圖3。

圖1 間斑寇蛛毒液致大鼠疼痛的免疫組化染色(×400)

圖2 不同毒液劑量致痛與治療組P2X3、CGRP、COX-2和IK 1蛋白的表達

圖3 致痛組與治療組P2X3、CGRP、COX-2、IK 1蛋白相對表達量分析

2.3 熒光定量PCR結果福爾馬林治療組P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA差異無統計學意義(P＞0.05);10μL/kg治療組大鼠脊髓中P2X3和CGRPmRNA的表達高于致痛組，COX-2和IK1 mRNA的表達低于致痛組，差異有統計學意義(P＜0. 05);40μL/kg治療組P2X3和IK1 mRNA的表達高于致痛組，CGRPmRNA的表達低于致痛組，差異有統計學意義(P＜0.05)，COX-2 mRNA的表達差異無統計學意義(P＞0.05);100μL/kg治療組P2X3、CGRP、和COX-2 mRNA的表達均高于致痛組，IK1 mRNA的表達低于致痛組，差異統計具有學意義(P＜0.05);300μL/kg治療組P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA的表達均高于致痛組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。各致痛組間P2X3、CGRP、COX-2和IK1 mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖4。

3 討論

新疆是間斑寇蛛咬傷人畜最多的地區之一，間斑寇蛛毒素具有很強的致痛作用，該毒素可以使患者咬傷部位、腹部及全身肌肉疼痛［6］，明確的間斑寇蛛毒致痛機制以及有效緩解疼痛的藥物還未見報道。本實驗通過免疫組化、Western blotting和熒光定量PCR技術在組織學水平、蛋白水平和分子水平檢測P2X3、CGRP、COX-2和IK1蛋白表達量，而前兩者與后者卻相反，可能的最主要原因為蛋白與mRNA表達的過程中受到各種外界因素的干擾，一方面可能與實驗過程中某個環節出錯有關，另外可能與實驗設計不足有關，因此本實驗結果有待進一步深究和改進。得出的結果說明間斑寇蛛毒素的致痛機制可能與因子P2X3、CGRP、COX-2和IK1蛋白的高表達有關。

圖4 致痛組與治療組P2X3、CGRP、COX-2、IK 1基因相對表達量

葡萄糖酸鈣在一定程度上能夠抑制部分因子P2X3、CGRP、COX-2和IK1蛋白的表達，起到抑制疼痛傳遞的作用。其可能機制為:(1)由于葡萄糖酸鈣治療中具有更多的Ca2+離子，其在激活的P2X3介導傷害性的Ca2+電流過程中能進一步激活P2X3，從而抑制疼痛的發生［7-8］。(2)降鈣素基因相關肽(CGRP)是一種含有37個氨基酸的神經肽［9］，廣泛分布于哺乳動物和人的中樞和外周神經系統感覺神經C-纖維末梢及組織器官中，CGRP通過抑制SP的降解，促進SP從感覺神經末梢釋放，參與到疼痛傳遞的過程中，并且CGRP具有能與其他炎性介質形成水腫的作用［10］。本實驗發現間斑寇蛛毒素致痛后，CGRP表達并無明顯變化，葡萄糖酸鈣治療組CGRP表達量明顯減少，說明葡萄糖酸鈣能通過減少CGRP表達途徑明顯地抑制疼痛的發生，且可能同時通過CGRP的表達途徑抑制神經元細胞水腫的發生，但其作用機制有待進一步研究。(3)環氧合酶(COX-2)是催化花生四烯酸生成前列素的一個重要的限速酶，參與了機體許多生理和病理過程，在福爾馬林致痛的炎性反應介導痛敏的產生中起著非常重要的作用［11-13］。高濃度致痛組與治療組COX-2均有高表達，說明葡萄糖酸鈣并不能使COX-2的表達降低。這與本實驗其他因子的表達結果相反。(4)間斑寇蛛毒致痛的大鼠脊髓組織中無炎性細胞的浸潤，且在24 h很短的時間內，IK1mRNA的表達大幅的提高，說明該毒素具有直接的神經毒性作用，而非慢性的炎性細胞浸潤，這種急性的疼痛感為毒素對神經細胞的直接作用，且IK1在疼痛傳遞的過程中起到重要的作用。葡萄糖酸鈣治療組的表達降低，其機制尚不可知。因此間斑寇蛛毒素導致的疼痛與毒液劑量呈依賴性，是一個復雜的神經傳遞物質及離子電流等相互作用的過程，還有待于進一步研究。

通過對大鼠脊髓后角神經元疼痛傳遞物質及神經元鈣離子通道蛋白的深入探討，可以證實葡萄糖酸鈣具有部分緩解間斑寇蛛毒致痛的作用，間斑寇蛛毒液的致痛與部分致痛因子CGRP、COX-2、P2X3、IK1的高表達有密切的關系，本實驗的不足會在后期實驗中進一步證實，繼續從致痛因子表達方面深入探討間斑寇蛛毒致痛機制及葡萄糖酸鈣緩解疼痛的作用。

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Inhibitory effect of calcium gluconate on induced pain factor in Latrodectus tredecimguttatus venom induced pain in rats

LIU Juan juan，DONG Xin ling，KOU Xiaowen，SUN Hui
(Department of Emergency Center，The Second Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830063，China)

Objective This study were designed to explore the inhibitory effect of calcium gluconate on the relative expression amount of induced pain factors including potassium ion channel protein calcium ion dependent(IK1)，calcitonin gene related peptide(CGRP)，cyclooxygenase 2(COX-2)，purinergic receptor(P2X3)in the rat spinal cord induced by Latrodectus tredecimguttatus venom，and to study the treatment effectof calcium gluconate on pain.Methods 80 male SD rats were randomly divided into pain group，(40)and calcium treatment group (40)，the treatment group ratswere given vein injection of 2mL of 10%calcium gluconate pre tail;the other two groups of rats were given injection of 150μL of 5%formalin solution and Latrodectus tredecimguttatus toxin of 4 kinds of concentrations(10，40，100，300μL/kg).The rats were killed after 24 h and the L4-5 spinal cord was collected.The relative expression of CGRP，COX-2，P2X3，IK1 was analyzed by using immunohistochemicalmethod，Western blottingmethod，and real-time fluorescence quantitative PCR technology.Results Compared with the induced pain group，the expression of induced pain factor in the treatment group decreased significantly(P＜0.05) by immunohistochemicalmethod and Western blottingmethod in a dose of300μL/kg，The restof the concentration of treatment group compared with the induced pain were significantly different(P＜0.05)，but no regularity.The results of real time fluorescentquantitative PCR are contrary to the previous two.Conclusion The possiblemechanisms of pain induced by Xinjiang Latrodectus tredecimguttatus venom may be related to the level of relative expression of pain factors in rat spinal cord including CGRP P2X3，COX-2，IK1，and calcium gluconate could significantly inhibit the relative expression of CGRP，P2X3，COX-2，IK1 induced by high concentration toxin and slower the pain transfer.

calcium gluconate;Latrodectus tredecimguttatus venom;induced pain factor;inhibitory effect

R4;R9;Q96

A

1009-5551(2015)06-0706-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.011

2014-11-05］

(本文編輯楊晨晨)

國家自然科學基金(81060153)

劉娟娟(1986-)，女，在讀碩士，研究方向:急診與危重病研究。

董新玲，女，副教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向:急診與危重病研究，E-mail:dongxinlingjzk@163.com。