熒光定量RT-PCR檢測新疆變應性鼻炎患者外周血T細胞IL-2及MEF2 m RNA的表達水平

趙秀，高麗，張海蓉，姜孝芳(新疆醫科大學，烏魯木齊830011)

熒光定量RT-PCR檢測新疆變應性鼻炎患者外周血T細胞IL-2及MEF2 m RNA的表達水平

趙秀，高麗，張海蓉，姜孝芳
(新疆醫科大學，烏魯木齊830011)

目的探討新疆變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)患者外周血CD4+T淋巴細胞中IL-2及MEF2mRNA的表達水平，比較其表達的差異性。方法應用實時熒光定量RT-PCR技術檢測53例變應性鼻炎患者和39例健康對照者外周血CD4+T淋巴細胞中IL-2及MEF2 mRNA的表達水平。結果2-△△Ct方法分析結果顯示變應性鼻炎組患者的IL-2mRNA表達水平為(10.45±2.39)，高于健康對照組(8.67±2.27)，其差異具有統計學意義(P＜0.05)。變應性鼻炎組患者的MEF2mRNA的表達水平為(3.83±2.23)，健康對照組為(3.57±1.08)，其差異無統計學意義(P＞0.05)。維吾爾、漢變應性鼻炎患者的IL-2 mRNA和MEF2 mRNA基因表達無明顯差異(P＞0.05)。結論變應性鼻炎組基因IL-2mRNA表達水平高于健康對照組，而MEF2mRNA基因表達在兩組之間無明顯差異。維吾爾、漢變應性鼻炎患者的IL-2mRNA和MEF2 mRNA基因表達無明顯差異(P＞0.05)。

變應性鼻炎;IL-2mRNA;MEF2mRNA;RT-PCR

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見病及多發病，是一個全球性健康問題，目前全球有20%～30%的人群患有AR，而且患病率仍在不斷上升［1］。AR是機體接觸變應原后主要由IgE介導的鼻黏膜非感染性炎性疾病［2］。

我國11個城市多中心成人AR自報患病率為10%～20%［3］，其中患病率最低的地區為北京(8.7%)，患病率最高的地區為烏魯木齊(24.1%)。有研究顯示AR的發病受環境的因素影響［4］。安揚等［5］在對新疆過敏性鼻炎的流行病學調查中發現漢族的發病率(33.36%)明顯高于維吾爾族(19.19%)。研究顯示IL-2 mRNA的分化不均可引起Th1/Th2細胞分泌失衡從而引起變應性鼻炎的發生，其在變應性鼻炎患者及健康人群外周血中的表達水平具有差異性。而對于MEF2 mRNA的研究較少，MEF2 mRNA表達異常可引起T細胞異常分化，可能會引起變應性鼻炎的發生，但目前沒有直接證據證明其表達差異與變應性鼻炎有關。本研究應用實時熒光定量RT-PCR技術檢測變應性鼻炎患者和正常對照者外周血CD4+T淋巴細胞中IL-2、MEF2 mRNA的表達水平，旨在探討2種基因在變應性鼻炎患者與健康者及不同民族變應性鼻炎患者之間的差異，進而分析其在變應性鼻炎發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2012年12月-2013年11月在新疆醫科大學第一附屬醫院及新疆維吾爾自治區人民醫院呼吸科門診及病房的變應性鼻炎發作期患者53例為變應性鼻炎組，平均年齡(23.47±3.80)歲，其中維吾爾族27例，漢族26例，均在當地居住5 a以上者，并排除COPD、過敏性皮炎、高血壓、糖尿病、孕婦及＞60歲老年患者。選取新疆醫科大學健康志愿者39例為健康對照組，年齡(21.43±2.45)歲，既往無哮喘病史、過敏性疾病史及心血管疾病史，體檢均正常者。所有受試者均在征求知情同意后接受試驗。

1.2 標本采集及分離CD4+T淋巴細胞變應性鼻炎組及健康對照組均采集5 mL外周血，EDTA抗凝，采用免疫磁珠吸附法分離所需的CD4+T細胞。細胞分離出后將細胞移入凍存管中，將凍存管用封口膜封好放入液氮中凍存。

1.3 RNA抽提用Trizol法抽提細胞總RNA，具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4 cDNA合成具體操作按逆轉錄試劑盒說明書進行，將逆轉錄好的cDNA放入-20℃冰箱凍存。1.5實時熒光定量RT-PCR檢測IL-2、MEF2、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由Life Technologies公司提供。PCR反應體系為20μL:SYBR Green master 10μL，ddH2O 6μL，cDNA 2μL，上、下游引物各1μL。PCR擴增條件為95℃5 min總變性，95℃10 s，59℃30 s，進行45個循環。結果計算:通過相對定量以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達量。

1.6 統計學處理采用SPSS17.0統計軟件對結果進行統計學分析，應用兩獨立樣本均數t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內參基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的標準曲線以同一標本在不同管內做IL-2、MEF2基因的標準曲線，其擴增效率保持在85%～105%，符合進一步試驗要求。

2.2 內參基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的擴增曲線和溶解曲線熔解曲線為單一的主峰，說明產物為特異性擴增，見圖1～6。

2.3 IL-2、MEF2 m RNA定量結果

2.3.1 變應性鼻炎組與健康對照組IL-2、MEF2 mRNA表達比較變應性鼻炎組IL-2 mRNA基因表達水平高于健康對照組，其表達差異具有統計學意義(P＜0.05);兩組MEF2mRNA基因表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

圖1 GAPDH基因擴增曲線

圖2 GAPDH基因熔解曲線

圖3 MEF2m RNA擴增曲線

圖4 MEF2 m RNA熔解曲線

圖5 IL-2m RNA擴增曲線

圖6 IL-2m RNA熔解曲線

表1 變應性鼻炎組和健康對照組IL-2和MEF2基因m RNA表達水平(x s)

表1 變應性鼻炎組和健康對照組IL-2和MEF2基因m RNA表達水平(x s)

組別IL-2 MEF2變應性鼻炎組(n=53)10.45±2.39 3.83±2.23健康對照組(n=39)8.67±2.27 3.57±1.08 t值3.593 0.696 P值0.001 0.488

2.3.2 維吾爾、漢族變應性鼻炎患者IL-2和MEF2基因mRNA表達水平比較維吾爾、漢族變應性鼻炎患者IL-2mRNA基因表達差異無統計學意義(P＞0.05);維吾爾、漢族患者MEF2 mRNA基因表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 變應性鼻炎組中維吾爾族與漢族患者IL-2和MEF2基因m RNA表達水平(s)

表2 變應性鼻炎組中維吾爾族與漢族患者IL-2和MEF2基因m RNA表達水平(s)

族別IL-2 MEF2維吾爾族(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44漢族(n=26)10.48±3.07 3.69±2.85 t值-0.094 0.462 P值0.925 0.646

2.3.3 漢族變應性鼻炎患者與健康對照者IL-2mRNA基因表達比較漢族變應性鼻炎患者IL-2 mRNA基因表達水平高于健康對照者，其差異具有統計學意義(P＜0.05);漢族患者與健康對照者MEF2 mRNA基因表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 漢族變應性鼻炎患者和健康對照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

表3 漢族變應性鼻炎患者和健康對照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

組別IL-2 MEF2漢族變應性鼻炎患者(n=25)10.48±3.07 3.68±2.85健康對照者(n=39)8.67±2.85 3.57±1.07 t值2.726 0.274 P值0.008 0.806

2.3.4 維吾爾族變應性鼻炎組與健康對照組的IL-2 mRNA及MEF2基因mRNA水平基因表達比較維吾爾族變應性鼻炎患者組的IL-2 mRNA基因表達水平高于健康對照組，其差異具有統計學意義(P＜0.05);而MEF2 mRNA基因表達水平在維吾爾族變應性鼻炎組與健康對照組之間無統計學差異(P＞0.05)，見表4。

表4 維吾爾族變應性鼻炎患者和健康對照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

表4 維吾爾族變應性鼻炎患者和健康對照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

組別IL-2 MEF2維吾爾族變應性鼻炎患者(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44健康對照者(n=39)8.79±2.25 3.47±1.15 t值3.472 1.321 P值0.001 0.191

3 討論

變應性鼻炎是新疆的高發病，是由IgE介導的變態反應性疾病。近年來的研究認為CD4+T細胞及其相關細胞因子在變應性鼻炎的發展中起著重要作用［6］。CD4+T分泌多種細胞因子，其中Th1、Th2細胞分泌不均衡可能導致變應性鼻炎的發生，IL-2主要由Th1細胞分泌，可促進細胞介導的免疫應答，IL-2可誘導T淋巴細胞的分裂和增生，在T細胞增殖過程中具有非常重要作用。在機體受外源性感染后，IL-2的產生能力及機體對IL-2的反應能力降低，同時表達高親和性的IL-2R，產生免疫抑制物質，抑制T細胞功能，降低機體免疫功能［7-8］，從而引起炎性疾病的發生。IL-2還可以直接作用于B細胞，促進B細胞分化及抑制IgE分泌，還可能對B細胞有直接調節作用，并且促進體液免疫反應，使體內的巨噬細胞激活，而對變應性疾病產生影響。本研究結果證實在變應性鼻炎組與健康對照組外周血中的IL-2基因表達具有一定的差異，考慮該差異可能是影響變應性鼻炎發生的因素;而其在維吾爾族與漢族變應性鼻炎患者血中的表達并無差異，考慮該基因不是引起維吾爾、漢族變應性鼻炎發病率差異的影響因素。MEF2是肌細胞增強因子(myocyteenhancerfactor2，MEF2)，是一種最早發現與骨骼肌管中的特定的轉錄因子，是一種蛋白質，但其具有與DNA結合的活性，MEF2家族可分為MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D［9-10］。MEF2在多種腫瘤細胞中均有表達，在肝細胞癌、T細胞性白血病、T淋巴細胞瘤等腫瘤細胞中均能檢測到MEF2的存在，其均有異常表達，提示MEF2 mRNA與這些腫瘤的發生具有一定的關系，可能影響腫瘤的發生［11］。在小鼠實驗過程中發現，如果敲出小鼠細胞中的MEF2C，可以影響T細胞的形成，這種影響主要是通過阻斷T細胞早期的分化發育產生作用，使小鼠中T細胞的異常發育，引起與T細胞相關的疾病［12］。MEF2基因可以調節細胞因子基因的表達，可調節T細胞的表達和分泌。因MEF2基因在心肌、平滑肌等細胞中廣泛存在，可對肌細胞的分化發育產生影響，故考慮其對氣道的平滑肌產生作用而影響變應性鼻炎的發生。但本研究結果證實變應性鼻炎患者血中的MEF2基因水平與正常對照組并無明顯差異，故考慮MEF2的表達差異不會影響變應性鼻炎的發生。且維吾爾、漢族變應性鼻炎患者血中MEF2基因表達無明顯差異，考慮該基因不是引起維吾爾、漢族變應性鼻炎發病率差異的主要原因。目前對于MEF2基因的研究較少，增加樣本含量進行進一步試驗可能會得到更確切的結果。

本研究應用熒光定量RT-PCR技術對總體變應性鼻炎組與健康對照組進行檢測發現，變應性鼻炎組IL-2mRNA的基因水平高于健康對照組，其差異具有統計學意義(P＜0.05)，變應性鼻炎組與健康對照組MEF2 mRNA的基因水平無明顯差異(P＞0.05)。維吾爾族與漢族變應性鼻炎患者IL-2、MEF2mRNA基因水平均無明顯差異(P＞0.05)。提示IL-2基因對變應性鼻炎具有一定的作用，而MEF2基因可能對變應性鼻炎沒有明顯影響，其作用有必要進一步研究證實。由于本研究樣本量較小，如果擴大樣本量可能會得到更確切的線索。由于變應性鼻炎引起患者不適［13-14］，影響患者生活工作，所以解決變應性鼻炎的基因方面的研究仍需努力。本試驗為變應性鼻炎今后的治療方面提供了新的理論依據。

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Detection IL-2and MEF2 m RNA expression levels in allergic rhinitis patients' T cells of Xinjiang Uyghur and Han by real-timeRT-PCR

ZHAO Xiu，GAO Li，ZHANG Hairong，JIANG Xiaofang
(Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective To research the IL-2 and MEF2mRNA expression levels of Xinjiang allergic rhinitis(allergic rhinitis，AR)patients'peripheral blood CD4+T of lymphocytes，to compared the differences of the two genes between this two groups.Methods Application of real-time RT-PCR technique for detecting 53 caseswith allergic rhinitis and 39 patients with healthy controls CD4+T of peripheral blood lymphocytes in the IL-2 and MEF2 mRNA expression levels.Resu lts 2-△△Ctto analysis the results shows that the allergic rhinitis group's IL-2mRNA expression is(10.45±2.39)，higher than healthy control group(8.67±2.27)，the difference was statistically significant (P＜0.05).The allergic rhinitis group's MEF2 mRNA levels in is(3.83±2.23)，in the healthy control group is (3.57±1.08)，the difference has no statistically significant(P＞0.05).IL-2 mRNA and MEF2 mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).Conclusion Allergic rhinitis group's IL-2 mRNA gene expression levels higher than healthy control group;and MEF2mRNA gene expression has no significant differences between the allergic rhinitis group and the control group(P＞0.05).IL-2mRNA and MEF2mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).

allergic rhinitis;IL-2 mRNA;MEF2 mRNA;RT-PCR

R34

A

1009-5551(2015)06-0721-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.015

2015-03-12］

(本文編輯張巧蓮)

新疆維吾爾自治區自然科學基金(2013211B55);國家自然科學基金(81260006)

趙秀(1988-)，女，在讀碩士，研究方向:呼吸道變應性疾病。

姜孝芳，女，高級實驗師，博士，研究方向:呼吸道變應性疾病發病機制，E-mail:xinjiangjxf@163.com。

通信作者:高麗，女，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向:呼吸道變應性疾病，E-mail:xjmugaoli@sina.com。