TLR1在人成牙本質細胞和牙髓組織中的表達及意義

黃 黎 周麗珍

(瀘州醫學院免疫教研室，四川 瀘州 646000)

Toll樣受體(TLRs)屬于天然免疫識別受體，能夠直接或間接結合病原體，經吞噬及內化將病原體及其產物清除出去，是抵抗外來病原微生物入侵的第一道防線，在保護牙本質及牙髓組織健康中發揮重要作用〔1〕。已有報道指出TLR4在牙髓抵抗外來病原微生物入侵的宿主免疫防御中起到重要作用，而作為同一家族的TLR1是否有相似功能尚未可知。為此，本研究通過了解TLR1在人牙髓組織及成牙本質細胞層中的表達及分布，探討TLR1在牙髓牙本質復合體免疫防御中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 研究對象為本院口腔外科門診就診患者，年齡60～65歲，實驗組為臨床診斷為牙髓炎、需要拔除第三磨牙的患者，納入標準為牙體有深齲且有溫度刺激痛或自發痛但無牙周病的第三磨牙。對照組為牙體阻生需要拔除第三磨牙的患者，納入標準為牙體完整無齲病及牙周病的第三磨牙。兩組各獲得第三磨牙30顆，研究獲得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色觀察健康牙髓及炎癥牙髓TLR1的分布從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓固定24 h，后置于30%蔗糖溶液48 h。取出牙髓后包埋，利用恒冷冰凍切片機制成10μm切片，然后黏片、脫蠟，再用市售TLR1抗體(Santa cruz公司)進行免疫組化染色，觀察TLR1的表達及分布情況。

1.2.2 RT-PCR技術檢測健康牙髓及炎癥牙髓TLR1 mRNA的表達 從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓，提取組織及細胞總RNA，測定純度定量后按照逆轉錄試劑盒說明書(QIAGEN公司)逆轉錄合成cDNA，再以TLR1引物為模板進行PCR，檢測牙髓中TLR1 mRNA的表達。

1.2.3 Western印跡技術檢測健康牙髓及炎癥牙髓的TLR1蛋白 從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓，提取總蛋白，行蛋白電泳，轉膜，封閉，一抗孵育及二抗孵育后，最后進行TLR1蛋白的檢測。

2 結果

2.1 TLR1在牙髓組織的免疫組織化學染色 免疫組織化學法發現對照組即健康牙髓組織成牙本質細胞層TLR1陽性表達，部分牙髓內血管可見環狀著色，血管內存在陽性細胞(圖1A);牙髓內部未發現或偶爾有TLR1陽性細胞(圖1B)。而觀察組即牙髓炎患者牙髓內部可見TLR1強陽性表達(圖1C)。

2.2 Western印跡檢測TLR1的表達 Western印跡分析后發現觀察組和對照組牙髓及成牙本質細胞標本均于相對分子質量89 kD的位置有陽性條帶出現。見圖2。

圖1 TLR1在牙髓組織的免疫組織化學染色

圖2 Western印跡檢測TLR1的表達

2.3 TLR1 mRNA的表達 對兩組患者牙髓組織及成牙本質細胞標本總RNA進行RT-PCR，行瓊脂糖凝膠電泳發現觀察組和對照組標本在278 bp的位置均有條帶出現，與預期擴增產物大小類似。

3 討論

TLRs 是白介素-1受體(IL-1R)超家族成員，是人類進化中高度保守的分子家族，該類受體具備多種生物學功能:如可促進細胞因子的合成與釋放、誘發炎癥反應及抗病毒感染;還可誘導一氧化氮(NO)依賴性殺菌活性，促進免疫細胞表面表達相關免疫分子，促使免疫細胞的成熟等〔2，3〕。有研究發現，由TLRs誘導的非特異性免疫與感染、腫瘤及自身免疫性疾病密切相關，被認為是特異性免疫的啟動器〔4，5〕。人體包括口腔在內的各器官組織均存在TLRs，故對TLRs進行深入研究可為今后探索疾病的發病機制提供另一思路，對于臨床預防和治療疾病具有重要意義〔6，7〕。

TLR1是TLRs的重要組成之一，有報道指出TLR1廣泛分布于單核細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞等多種免疫細胞，可識別多種微生物中脂蛋白等分子模式，并通過TLR1/2異二聚體刺激免疫應答，與人類多種疾病的發病密切相關〔8～10〕。在口腔炎癥免疫方面，當前對TLRs研究較清楚的是TLR4和TLR2，而有關TLR1蛋白是否在牙髓組織表達、其表達情況與牙髓組織炎癥免疫有何種關系，國內尚無相關報道。

本組研究中免疫組化結果表明在正常牙髓血管內皮細胞、血管周圍及血管內均存在TLR1免疫反應陽性細胞，而PR-PCR結果亦表明正常牙髓組織有TLR1表達，可能與取出的牙髓組織中存在成牙本質細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞等可表達TLR1的免疫細胞有關，由此可認為TLR1在牙髓組織免疫應答過程中起到較大作用，可能通過誘發免疫應答從而引起血管內皮細胞等免疫細胞活化以避免病原微生物入侵。另外，免疫組化發現牙本質細胞質及突起以及位于成牙本質細胞層附近的樹突細胞膜及胞質均有TLR1表達，且發現在正常牙髓組織中成纖維細胞并未表達TLR1，牙齦及牙周膜成纖維細胞同牙髓成纖維細胞存在相似性，但觀察組牙髓組織的牙髓成纖維細胞TLR1則強陽性表達，與既往對TLR4的研究結果類似，提示TLR1表達與細胞分布部位及功能狀態相關〔7〕。正常狀態下牙髓成纖維細胞因為有成牙本質細胞包繞故不會受病原微生物刺激，但當牙本質被破壞后，牙髓成纖維細胞因外界病菌侵入就可能會活化并表達TLR1。

綜上所述，本研究發現牙髓組織中TLR1的表達情況與細胞分布、功能狀態等密切相關，具有和TLR4相似的時空特異性，在正常情況下戰略性分布于成牙本質細胞及牙髓內部血管周圍，為抵御外來病原微生物入侵做好準備，在牙髓及牙本質免疫復合體免疫防御反應中發揮重要作用。

1 閆 浩，李 妍，馬美娟，等.胰島素在巨噬細胞泡沫化過程中對Toll樣受體4表達的影響及其機制〔J〕．現代生物醫學進展，2013;13(9):1605-8，1604.

2 Khoo JJ，Forster S，Mansell A.Toll-like receptors as interferon-regulated genes and their role in disease〔J〕．J Interferon Cytokine Res，2011;31(1):13-25.

3 Kutikhin AG.Association of polymorphisms in TLR genes and in genes of the Toll-like receptor signaling pathway with cancer risk〔J〕．Hum Immunol，2011;72(11):1095-116.

4 Alexopoulou L，Desnues B，Demaria O.Toll-like receptor 8:the awkward TLR〔J〕．Med Sci(Paris)，2012;28(1):96-102.

5 Lee NY，Lee HY，Lee KH，et al.Vibrio vulnificus IlpA induces MAPK-mediated cytokine production via TLR1/2 activation in THP-1 cells，a human monocytic cell line〔J〕．Mol Immunol，2011;49(1-2):143-54.

6 Lancioni CL，Li Q，Thomas JJ，et al.Mycobacterium tuberculosis lipoproteins directly regulate human memory CD4(+)T cell activation via Tolllike receptors 1 and 2〔J〕．Infect Immun，2011;79(2):663-73.

7 Oosting M，Ter Hofstede H，Sturm P，et al.TLR1/TLR2 heterodimers play an important role in the recognition of Borrelia spirochetes〔J〕．PLoS One，2011;6(10):e25998.

8 Plantinga TS，Johnson MD，Scott WK，et al．Toll-like receptor 1 polymorphisms increase susceptibility to candidemia〔J〕．J Infect Dis，2012;205(6):934-43.

9 Dasari P，Zola H，Nicholson IC，et al.Expression of Toll-like receptors by neonatal leukocytes〔J〕．Pediatr Allergy Immunol，2011;22(2):221-8.

10 Zhu J，Krishnegowda G，Li G，et al.Proinflammatory responses by glycosylphosphatidylinositols(GPIs)of Plasmodium falciparum are mainly mediated through the recognition of TLR2/TLR1 〔J〕．Exp Parasitol，2011;128(3):205-11.