組織蛋白酶B、基質金屬蛋白酶-2在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

薛興陽 孟 江 周 明 趙光日 傅文凡 楊嶸皓 趙 健

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科，廣東 廣州 510095)

非小細胞肺癌(NSCLC)治療失敗和死亡的主要原因是瘤轉移與腫瘤侵襲。組織蛋白酶B(CB)是一種細胞溶酶體含巰基蛋白酶，主要與細胞外基質中層黏連蛋白的分解有關，層黏連蛋白是細胞基質間相互作用和與腫瘤侵襲、轉移有關的基底膜的主要成分，另外，它還可降解纖維連接蛋白、Ⅳ 型膠原等〔1〕。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是不僅可以降解基底膜和基質、突破基質屏障、促進腫瘤侵襲和轉移，而且還可通過毛細血管內生成及新生血管生成等方式促進腫瘤生長和擴散〔2〕。本研究應用免疫組織化學方法檢測NSCLC組織中CB和MMP-2蛋白的表達情況，并分析其與臨床病理特征的相互關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2004年1月至2005年12月在我院行NSCLC術后存檔的蠟塊，共75例，男53例，女22例，年齡33～76(平均58.1)歲，鱗癌33例，腺癌42例。患者術前均未經任何治療。同時選取病理證實為28例良性肺病變標本為對照。

1.2 納入標準 ①術前未經任何化療或放射治療。②進行根治性手術，術后病理證實為NSCLC，組織學分類明確的肺癌患者。③術后石蠟標本保存完好，有足夠待測組織標本者。

1.3 排除標準 ①術前作過放、化療及不能行根治手術者。②術后病理診斷組織學分類不明確者。③術后石蠟標本保存不完整者。

1.4 主要試劑 CB兔單克隆抗體購自美國Epitomics公司，MMP-2鼠單克隆抗體購自德國Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 免疫組織化學染色 免疫組織化學采用S-P法進行。具體步驟:脫蠟，水化組織切片，3%H2O2孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶;抗原修復后分別滴加一抗，室溫37℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3 次;滴加雙抗室溫孵育 20 min，PBS沖洗，5 min×3次;應用DAB顯色劑顯色;自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。本實驗中所有標本的檢測均由同一病理技師完成，并在顯微鏡下顯色觀察，嚴格質控。實驗中設用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5.2 染色判斷標準 細胞質染色為淡黃至棕黃色者為陽性細胞;每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，得出陽性細胞百分比;陽性細胞＜10%為0分，10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。按評分高低分級:0～1分定義為陰性表達，2分或以上為陽性表達。以上結果由兩位病理醫師獨立閱片并記錄。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 CB和MMP-2在NSCLC及肺良性病變組織中表達 CB和MMP-2在NSCLC中表達的陽性率(43/75，48/75)明顯高于良性肺病變(7/28，4/28

2.2 CB和MMP-2的表達與NSCLC臨床病理特征的關系如表1所示，低分化和中-高分化肺癌組織中的CB和MMP-2陽性表達水平無顯著性差異(P＞0.05);MMP-2表達的陽性率與有無淋巴結轉移的比較中差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 CB和MMP-2的表達與NSCLC臨床病理特征的關系

2.3 NSCLC中CB和MMP-2表達水平間的相關性 CB和MMP-2表達水平呈正相關(r=0.308，P=0.007)。

3 討論

NSCLC是指除小細胞癌以外的其他所有類型的肺癌，主要包括腺癌和鱗癌，是肺癌最常見的病理類型，約占所有肺癌患者的 80% ～85%〔3〕。

CB屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是細胞溶酶體中的一種半胱氨酸蛋白酶，為一肽鏈外切酶。在溶酶體的酸性環境中，其活性位點呈閉合環狀態。當pH值升高時，閉合環狀結構打開，從而成為肽鏈內切酶，在溶酶體降解蛋白質途徑中發揮著必不可少的作用。Kayser等〔4〕報道肺癌組織CB表達與肺癌患者病情發展、肺癌細胞分化程度相關及與肺癌淋巴結轉移相關。另有研究證實，下調或沉默CB在惡性腫瘤細胞中的表達，腫瘤細胞的侵襲能力則大大減弱〔5〕。CB能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質金屬蛋白酶等而間接降解細胞外基質成分〔6〕。近來很多研究在體外實驗通過反義或RNA干擾技術聯合沉默CB及其他蛋白酶類，取得明顯抑制腫瘤血管生成和侵襲轉移的作用〔7〕。本實驗與文獻報道不完全符合，可能是的樣本量少。

其中MMP-2由于能夠特異地降解細胞外基質和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，而被認為是在腫瘤侵襲轉移過程中最直接和最重要的基質金屬蛋白酶〔8〕。Passlick等〔9〕的前瞻性研究揭示，在早期階段的NSCLC中MMP-2過度表達預示不良的后果在NSCLC中高表達的MMP-2是肺癌好的腫瘤標記物。Thomas等〔8〕報道MMP-2在NSCLC表達率為41%，與肺癌的組織學類型、TNM分期無關，而與其分化程度、淋巴結轉移相關。呂志強等〔10〕用免疫組織化學法檢測42例肺癌組織中MMP-2蛋白的表達和微血管密度，結果顯示肺癌組織中MMP-2蛋白的表達與淋巴結轉移呈正相關，MMP-2高表達者的預后較差，且MMP-2與腫瘤血管形成有密切關系。Wang等〔11〕對現有非小細胞肺癌文章meta分析研究表明MMP-9高表達提示預后更差。本實驗結果表明MMP-2在NSCLC中表達高于肺良性病變，伴有淋巴結轉移的NSCLC的原發病灶MMP-2表達和無淋巴結轉移者。

本次實驗結果提示MMP-2和CB參與腫瘤的發生發展。NSCLC淋巴結轉移與患者的預后密切相關提示CB可能對預后評估有一定價值。總之，MMP-2和CB在NSCLC組織中表達上調，二者可能與NSCLC的發生發展有關，對活檢組織進行二者的聯合檢測，可能有助于預后的判斷。

1 李美寧，程牛亮.組織蛋白酶B與腫瘤〔J〕．國外醫學·腫瘤學分冊，2005;32(6):429-32.

2 Jones JL，Walker RA.Control of matrix metalloproteinase activity in cancer〔J〕．J Pathol，1997;183(4):377-9.

3 Finger EC，Turley RS，Dong M，et al．T beta RIII suppresses non-small cell lung cancer invasiveness and tumorigenicity〔J〕．Carcinogenesis，2008;29(3):528-35.

4 Kayser K，Richter N，Hufnagl P，et al．Expression，proliferation activity and clinical significance of cathepsin B and cathepsin L in operated lung cancer〔J〕．Anti Cancer Res，2003;23(3C):2767-72.

5 Gondi CS，Lakka SS，Yanamandra N，et al．Adenovirus-mediated expression of antisense urokinase plasminogen activator receptor and antisense cathepsin B inhibits tumor growth，invasion，and angiogenesis in gliomas〔J〕．Cancer Res，2004;64(12):4069-77.

6 Buck MR，Karustis DG，Day NA，et al．Degradation of extracellular marix proteins by human cathepsin B from normal and tumoral tissues〔J〕．Biochem J，1992;282(2):273-8.

7 Lakka SS，Gondi CS，Yanamandra N，et al．Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion，tumor growth and angiogenesis〔J〕．Oncogene，2004;23(27):4681-9.

8 Thomas P，Khokha R，Shepherd FA，et al．Differential expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in non-small cell lung cancer〔J〕．J Pathol，2000;190(2):150-6.

9 Passlick B，Sienel W，Seen-Hibler R，et al．Overexpression of matrix metalloproteinase 2 predicts unfavorable outcome in early-stage non-small cell lung cancer〔J〕．Clin Cancer Res，2000;6(10):3944-8.

10 呂志強，李海剛，謝德榮，等.肺癌組織中MMP-2表達及與腫瘤血管形成關系〔J〕．中國腫瘤，2004;13(6):378-80.

11 Wang J，Cai Y.Matrix metalloproteinase 2 polymorphisms and expression in lung cancer:a meta-analysis〔J〕．Tumour Biol，2012;33(6):1819-28.