VEGF-C及其受體VEGFR-3和D2-40在老年喉癌組織中的表達及臨床意義

葉成剛 李偉利

(湖北江漢油田總醫院，湖北 潛江 433124)

喉癌的發病特點為高發病率、高復發率、晚期比例高以及治療耐受力差〔1〕。研究表明，淋巴管生成在惡性淋巴侵襲和轉移過程中起到重要的作用。有研究報道，血管內皮生長因子C(VEGF-C)及其受體(VEGFR-3)可能通過促進血管內皮細胞生成影響血管、淋巴管生成，與腫瘤轉移密切相關〔2〕。本研究通過免疫組化方法檢測喉癌組織、癌旁組織標本中VEGF-C、VEGFR-3的表達，旨在探討其表達水平與老年喉癌臨床特征的關系，為喉癌發病機制的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2014年6月在我院手術切除的老年喉癌組織、癌旁組織(距離腫瘤切緣＞0.5 cm)標本68例，均經病理診斷證實為鱗狀細胞癌，癌旁組織經病理證實為炎癥和正常組織，患者術前均未行放療和化療;選擇同期我院接受手術治療30例患者正常喉黏膜組織標本作為對照，術后病理診斷為正常組織。老年喉癌患者中，男35例，女33例;年齡66～79〔平均(71.1±7.6)〕歲;吸煙量＞400 支/年患者 44例，≤400支/年患者24例;癌腫＞3 cm患者44例，癌腫≤3 cm患者24例;病理學分級:G1級17例，G2級23例，G3級28例;喉癌分型:跨聲門型10例，聲門上型32例，聲門型26例;TNM分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期14例，Ⅲ期22例，Ⅳ期23例;淋巴轉移組40例，無淋巴轉移28例。正常對照組男16例，女14例;年齡65 ～78〔平均(70.3±6.9)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測 應用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組織化學染色法，所有標本經4%甲醛固定、石蠟包埋，按常規4μm制成連續的切片，用二甲苯脫去蠟、梯度乙醇脫水。用新鮮配置的3%甲醇過氧化氫處理;VEGF-C、VEGFR-3采用枸櫞酸緩沖液修復抗原;D2-40使用Tris-EDTA緩沖工作液修復抗原。均加一抗(稀釋濃度 VEGF-C、VEGFR-3為1∶100，D2-40為1∶50)，加入山羊血清在 4℃下孵育過夜;加入PBS緩沖液沖洗，加二抗10 min、三抗10 min，PBS緩沖液沖洗，流水沖洗，DAB顯色、加入蘇木素復染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 結果判定 VEGF-C、VEGFR-3表達由兩位病理科醫師在未知臨床資料的情況下判定，以細胞黃色顆粒為陽性細胞。按照Fromowitz等的合計分法〔3〕，將陽性著色細胞所占百分比與細胞著色強度兩者結合判定，得出陽性率，包括:(1)陽性細胞百分數為5個視野中陽性細胞的平均數占視野中細胞數的比例，陽性細胞率≤25%計0分，26% ～50%計1分，51% ～70%計2分，＞70%計3分;(2)按多數陽性細胞的染色強度計分:無色計0分，多數陽性細胞呈淺棕黃計1分，多數陽性細胞呈棕黃計2分，多數陽性細胞呈棕褐計3分，將以上兩項積分相加:0分為陰性，＞0分為陽性，并計算陽性百分率。

D2-40陽性淋巴管判斷標準及計數方法:參照Weidner方法進行微淋巴管計數，在高倍鏡(400倍)下對淋巴管進行計數，每份計數 4個視野，取其平均值為LVD(D2-40陽性脈管數/HP)〔4〕。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行分析，計數資料用x±s表示，進行Kruskal-Wallis H檢驗、χ2檢驗，計量資料用t檢驗。應用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達 VEGF-C、VEGFR-3在喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中均有表達，差異有統計學差異(P＜0.01)。其中，VEGF-C與VEGFR-3在喉癌組織標本中的陽性表達率(73.5%，72.1%)顯著高于癌旁組織(25.0%，27.9%)和正常喉黏膜組織(3.3%，3.3%)(均P＜0.01)，見表1。D2-40在喉癌組織中的表達為(8.164±3.261)，顯著高于癌旁組織(2.186±0.452)和正常喉組織(2.677±0.197)(P＜0.05)。

2.2 喉癌組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表達與臨床病理特征的關系 見表2。VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達與臨床分期、淋巴轉移及臨床分型有關(均P＜0.05)，與病理分級、吸煙史、腫瘤的大小和性別無關(P＞0.05)。

2.3 喉癌組織中 VEGF-C、VEGFR-3和 LVD的相關性Spearman相關分析顯示VEGF-C與VEGFR-3兩者表達率呈正相關(r=0.899，P＜0.01)。

表1 喉癌組織、癌旁組織及正常喉組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表達情況比較〔n(%)〕

表2 喉癌組織中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表達與臨床病理特征的關系

3 討論

VEGF-C是由Joukov等用親和層析法分離得到的與肝素結合的生長因子，與VEGF-A具有高度同源性，是近年來研究的熱點之一。VEGF-C可以促使血管內皮細胞分裂、增殖，從而起到促進新血管形成的作用，在這一過程中血管通透性明顯增強〔5〕。VEGFR-3是酪氨酸蛋白激酶家族受體，屬于VEGF-C特異性受體，主要位于淋巴管的內皮細胞，臨床研究〔6〕發現，VEGF-C在多種腫瘤組織中比正常組織表達高，在選擇的35個腫瘤標本中共檢測到19個標本具有VEGF-C mRNA的表達。D2-40是一種淋巴管內皮細胞標志物，可以特異地與癌胚抗原M2A結合，當前作為新生淋巴管內皮細胞標志物特異性最高〔7〕。

研究結果提示，VEGF-C和VEGFR-3的表達與喉癌轉移有關。惡性腫瘤中VEGF-C表達的升高并導致淋巴轉移是由于惡性腫瘤細胞產生的VEGF-C與VEGFR-3結合后快速產生磷酸化，誘導胞質內信號的傳導，進而使DNA有絲分裂旺盛，引起淋巴管內皮細胞增生從而導致淋巴管增生，使淋巴管的通透性增高，增大腫瘤淋巴道轉移的可能性〔7，8〕。

本研究提示D2-40可能參與喉癌的發生和發展。在乳腺癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌等腫瘤中證實LVD可以作為腫瘤淋巴管生成的重要指標，國內外學者研究發現VEGF-C及其受體VEGFR-3在癌組織中的高表達與LVD及淋巴結轉移呈正相關性〔9，10〕。正常情況下，淋巴管內皮細胞為靜止狀態，而在外傷、炎癥或者腫瘤情況下，淋巴管內皮細胞會遷移至局部組織并在生長因子作用下形成淋巴管〔11〕。癌細胞侵入到淋巴管被認為是基于增強癌細胞的侵襲性或是癌細胞產生消化酶對其基質破壞，產生的VEGF-C可以引起周圍淋巴管增生與擴張，同時癌細胞也很容易侵入淋巴管，通過侵襲腫瘤病灶周邊原有的淋巴管系統進入淋巴液進而形成淋巴結轉移〔12〕。

此外，VEGF-C可能通過多條通路激活淋巴上皮細胞內膜上的受體引起腫瘤細胞淋巴管的增生。此外，筆者認為，腫瘤細胞可能通過旁分泌途徑分泌VEGF-C并與淋巴管內皮細胞上相關受體結合，從而使VEGFR-3酪氨酸酶產生磷酸化，導致腫瘤周圍淋巴管生成和擴張，增加腫瘤轉移擴散的可能性〔13〕。而通過深入研究D2-40，并通過阻斷VEGF-C和VEGFR-3信號傳導通路表達，有望成為阻斷癌細胞經淋巴道轉移的重要手段之一。

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2 劉新蘭，李亦工，馬志蘭，等.胃癌組織中VEGF-C、VGFR-3表達和微淋巴管密度的研究〔J〕．寧夏醫學雜志，2014;36(5):385-7.

3 Joukov V，Pajusola K，Kaipainen A，et al．A novel vascular en-dothelial growth factor，VEGF-C is a ligand for the Flt4(VEG-FR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases〔J〕．EMBO J，1996;15(2):290-8.

4 白云飛，覃 潔，彭詩東.喉癌組織中Survivin和VEGF的表達及其臨床意義〔J〕．中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2012;33(1):5-9.

5 武彥昭，施惠晶，景尚華，等.喉癌組織中VEGF-C及其受體VEGFR-3和D2-40的表達及意義〔J〕．山東醫藥，2013;53(41):4-7.

6 Ran S，Volk L，Hall K，et al．Lymph angiogenesis and lymphatic metastasis in breast cancer〔J〕．Pathophysiology，2010;17(4):229-51.

7 王 瑩，李文媛，賈 樺，等.喉癌組織中VEGF-D表達與淋巴管生成及預后的關系〔J〕．解剖科學進展，2011;17(2):116-20.

8 Hirakawa S，Brown LF，Kodarna S，et al．VEGF-Cinducedlymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor me-tastasis to distant sites〔J〕．Blood，2007;109(3):1010-7.

9 王中亮，陳 堯，李瑞祥.血管內皮生長因子C及其受體VEG-FR23的研究進展〔J〕．腫瘤防治雜志，2002;9(Suppl 5):454.

10 王開昕，王 晶，雷立容，等.非小細胞肺癌組織中VEGF-C表達與淋巴轉移的關系〔J〕．中國當代醫藥，2013;20(26):56-7，59.

11 王海濤，金宏林，王 瑩，等.CXCR4和VEGF-C在喉癌中的表達及與淋巴結轉移的關系〔J〕．中國老年學雜志，2009;29(3):340-2.

12 李文媛，王景霞，王 瑩，等.VEGF-C在喉癌組織中的表達及臨床意義〔J〕．牡丹江醫學院學報，2009;30(5):4-7.

13 趙海濱，吳國忠，徐桂芳，等.胃癌組織中VEGF-C、VEGF-D、MMP-9的表達變化及意義〔J〕．山東醫藥，2009;49(50):18-20.