大鼠海馬認知障礙對糖脂代謝的影響及其與海馬神經元凋亡的關系

杜 森 夏春波 葉 琳 莫文法 鐘毓娟 莫 剛 王海俠

(桂林醫學院人體解剖學教研室，廣西 桂林 541004)

阿爾茨海默病(AD)和糖尿病(DM)是一組相互關聯的復雜性疾病，有研究表明，60% ～70%的DM患者存在不同程度的認知功能障礙，主要表現為學習和記憶能力降低，其發生癡呆的危險性顯著增加〔1，2〕，而高達81%的AD患者有不同程度的糖代謝異?！?〕。本研究擬分析血糖血脂水平與大鼠海馬腦區神經元凋亡的關系，為代謝異常的深入研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Spraque-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄不分，體重200～250 g，均由桂林醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK桂2007-000。水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司，Aβ1～42購自Sigma公司，微量注射器購自西化儀(北京)科技有限公司，血糖血脂檢測試劑盒購自桂林優利特集團有限公司，全自動生化分析儀為德國Erba XL-600，凋亡檢測試劑盒TUNEL(POD)(Roche USA)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 認知障礙大鼠模型的建立及實驗分組 參照大鼠腦立體定位圖譜，調整腦立體定位儀，大鼠經10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，頭部備皮后固定于腦立體定位儀上，沿頭頂正中切開長約10～15 mm的縱形切口，分離骨膜，在海馬上方用牙科鉆鉆開顱骨，實驗組大鼠海馬注射(前囟后3.8 mm，左旁開2.2 mm，進針2.9 mm)Aβ1～4215 μg，假手術組注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，對照組未施加任何干擾因素。利用水迷宮實驗檢測大鼠認知能力，認知功能障礙判定標準:以大鼠從入水至爬上平臺時間(定位航行)、跨越平臺次數、在原平臺象限時間百分比三項中的任意兩項與對照組差異有統計學意義判定為認知功能障礙。

1.3 大鼠血糖血脂水平檢測 造模后大鼠繼續飼養45 d，經心臟采血后分離血漿，應用全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。

1.4 TUNEL法檢測大鼠海馬神經元凋亡 大鼠經10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，心臟灌注固定，斷頭取腦，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蛋白酶K 37℃孵育20～30 min，浸入3%過氧化氫溶液10 min，PBS洗3 min×3次，滴加50μl TUNEL反應混合液，在避光盒中37℃孵育1 h，PBS洗3 min×3 次，滴加 Converter-POD50 μl，37℃ 孵育 30 min，PBS 洗3 min×3次，DAB顯色，中性樹膠封片。以等量標記液(不含末端轉移酶)代替TUNEL工作液做陰性對照。結果判定:以細胞核內出現棕黃色或黃色顆粒為陽性神經元，在顯微鏡下隨機選擇高倍視野進行凋亡神經元計數，凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 認知障礙大鼠血糖血脂水平 大鼠飼養45 d后，表現為體重減輕，體型偏瘦，皮膚粗糙且黯淡無光，全自動生化分析儀檢測結果顯示，實驗組大鼠FPG、TG、TC、LDL與假手術組和對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，HDL未見明顯變化(P＞0.05)。見表1。

表1 認知障礙大鼠血糖血脂水平(x±s，mmol/L，n=10)

2.2 認知障礙大鼠海馬神經元凋亡 凋亡神經元細胞核被染成棕黃色或黃色，染色深淺不一。實驗組大鼠海馬神經元凋亡指數為71.37%±3.15%，假手術組和對照組大鼠僅見有零星凋亡神經元，且染色較淺，凋亡指數分別為18.66%±3.20%、15.36%±4.25%，與實驗組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 認知障礙大鼠海馬CA1區TUNEL染色結果(×400)

3 討論

AD和DM關系密切，兩者不僅在認知功能和能量代謝等方面具有相似的臨床表現，而且具有許多共同的病理生理基礎，如胰島素信號傳導途徑異常、糖基化終末產物(AGEs)增加、氧化應激、炎癥反應等均可能參與疾病發生，但其具體發病機制尚未明確〔4〕。目前，許多學者〔5〕對DM引起AD進行了大量研究，但AD發病早期是否出現血糖血脂水平改變知之甚少，黃德弘等〔6〕對AD和血管性癡呆(VD)患者血糖、血脂及尿酸水平進行了研究，結果 AD和VD患者 FPG、TC、TG、LDL水平均顯著升高，但HDL水平表現為明顯降低，認為AD和VD患者均存在糖脂代謝紊亂，降脂降糖治療可改善AD和VD臨床癥狀。本實驗研究結果顯示高血糖高血脂大鼠海馬結構發生了形態學改變，推測大鼠血糖血脂水平升高可能與海馬神經元凋亡有關，提示AD可能是導致糖尿病糖脂代謝異常的重要因素之一。在解剖結構上，海馬神經纖維聯系廣泛，它與下丘腦、杏仁核、腦干均有極其復雜的聯系，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA軸)是神經內分泌途徑的主要傳出通路，中樞神經系統可以通過HPA軸來調節外周器官活動，刺激海馬CA3區、齒狀回和腹側下腳可導致血漿皮質醇明顯下降，損傷海馬結構如腹側下腳導致糖皮質激素分泌增加〔7〕。Forray等〔8〕認為，海馬與下丘腦室旁核(PVN)之間存在直接的神經聯系，也可通過前腦終紋床核(BNST)和其他下丘腦中繼核團豐富的γ-氨基丁酸(GABA)能神經元影響PVN神經內分泌細胞活性，從而實現對HPA軸的調節。基于AD與DM的相似性，有學者認為，抑制海馬神經元凋亡可能對DM腦病和AD的防治均有重要價值〔9，10〕。

1 Petrova M，Prokopenko S，Pronina E，et al．Diabetes type 2 hypertension and cognitive dysfunction in middle age women〔J〕．J Neurol Sci，2010;299(1-2):39-41.

2 Manschot SM，Brands AM，vander Grond J，et al．Brain magnetic resonance imaging correlates of impaired cognition in patients with type2 diabetes〔J〕．Diabetes，2006;55(4):1106-13.

3 Biessels GJ，Staekenborg S，Brunner E，et al．Risk of dementia in diabetes mellitus:a systematic review〔J〕．Lancet Neurol，2006;5(1):64-74.

4 Rao BS，Gupta KK，Karanam P，et al．Alzheimer disease:An interactome of many diseases〔J〕．Ann Indian Acad Neurol，2014;17(1):48-54.

5 趙詠梅，閆 穎，趙志煒.β淀粉樣肽42及神經生長因子在實驗性糖尿病腦病小鼠海馬內表達的變化研究〔J〕．首都醫科大學學報，2013;34(6):851-5.

6 黃德弘，劉孟淵.阿爾茨海默病和血管性癡呆患者血脂、血糖及尿酸水平的變化〔J〕．廣東醫學，2013;34(4):587-9.

7 Mueller NK，Dolgas CM，Herman JP.Stressor-selective role of the ventral subiculum in regulation of neuroendocrine stress responses〔J〕．Endocrinology，2004;145(8):3763-8.

8 Forray MI，Gysling K.Role of noradrenergic projections to the bed nucleus of the stria terminalis in the regulation of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis〔J〕．Brain Res Rev，2004;7(1-3):145-60.

9 馬樓艷，張棟珉，張 穎，等.Ghrelin對糖尿病大鼠海馬神經元凋亡及其認知功能的影響〔J〕．基礎醫學與臨床，2011;31(6):672-8.

10 Perez-Cruz C，Nolte MW，van Gaalen MM，et al．Reduced spine density in specific regions of CA1 pyramidal neurons in two transgenic mouse models of Alzheimer＇s disease〔J〕．J Neurosci，2011;31(10):3926-34.