苗藥九仙羅漢接骨湯干預對兔骨折模型的病理染色變化及血管內皮生長因子表達的作用

楊彥君 熊 屹 唐良華 易洪城 程志剛 敬 戈

(貴陽中醫學院第二附屬醫院骨二科，貴州 貴陽 550003)

中醫藥治療骨折具有減輕疼痛、消腫、縮短療程、功能恢復好等特點。苗藥九仙羅漢接骨湯由仙桃草、九節茶、地羅漢三味苗藥組成，具有活血散瘀通絡，接骨消腫止痛之功效〔1〕。本研究探討苗藥九仙羅漢接骨湯促進骨折愈合不同時相點的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雌雄各半新西蘭大耳白兔120只，體重為2.5～3.0 kg，由貴陽醫學院動物實驗中心提供。

1.2 實驗藥物 九仙羅漢接骨湯煎劑:由地羅漢、仙桃草、九節茶組成。按傳統方法煎煮，制備所需濃度的煎劑，保存備用。三七粉:將三七粉溶于水后滅菌備用，含生藥0.02 g/ml。

1.3 實驗試劑 人抗兔血管內皮生長因子(VEGF)、即用型S-P免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);南美胎牛血清(貴陽愛瑞生物有限公司提供)。

1.4 造模 依據標準動物造模〔2〕。新西蘭大白兔右脛骨前部中段用線鋸造成寬3 mm深2 mm的骨缺損，深度達髓腔，生理鹽水沖洗，青霉素16萬U撒入創面預防感染，術畢縫合傷口，不予外固定。術畢分籠飼養，提供標準飼料，自由進食、水和自由活動。術后3 d每日早晚給予青霉素40萬U肌注抗感染。

1.5 分組及給藥 新西蘭大白兔隨機分為三組:接骨湯組，三七對照組，生理鹽水組。①接骨湯組:灌胃給苗藥九仙羅漢接骨湯煎劑(1 ml/kg)。②三七對照組:灌胃給同體積三七粉液(1 ml/kg)。③生理鹽水組:灌胃給同體積生理鹽水。所有動物于骨折當天開始給藥，術后7、14、21、28 d分批處死，每組各10只。

1.6 動物取材和標本處理 給藥試驗后于7、14、21、28 d，各組動物按時間段在兔耳緣靜脈空氣注射處死動物，截取骨折中心上下各1 cm脛骨骨干，中性甲醛固定，用于HE及VEGF表達檢測。

1.7 方法

1.7.1 HE染色檢測 以骨缺損處為中心取長度約1 cm的脛骨骨干，將其置于40 g/L多聚甲醛溶液4℃下固定脫鈣〔3〕。HE水洗，藍化，中性樹膠封固。切片后用200倍光學顯微鏡觀察HE染色結果。

1.7.2 VEGF表達檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產的VEGF免疫組化，S-P試劑盒對標本VEGF的表達進行免疫組化檢查。石蠟塊作縱向間斷連續切片(3μm)，脫蠟后經甲醇雙氧水封閉內源性酶，南美胎牛血清封閉非特異性染色，ABC法檢測骨痂組織中VEGF表達。使用即用型S-P免疫組化試劑盒，標本經一抗、二抗、ABC復合物處理，DAB顯色后DPX封片，鏡檢，10×40倍顯微鏡下觀察，呈棕色著色為VEGF陽性表達;每個標本再在10×10倍光鏡下隨機抽取3個視野作陽性表達計數，以3個視野計數均值作為各標本VEGF表達的計量指標。

1.8 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結果

2.1 病理組織學檢查 切片檢查可見九仙羅漢接骨湯組兩骨端生長新骨的時間較早，范圍大，軟骨內成骨過程較快，兩端骨髓腔較早形成連接，28 d骨髓腔已完全貫通。三七對照組及生理鹽水組兩骨端出現新骨的時間較晚，軟骨區范圍較大，軟骨內成骨過程時間長，骨痂生長相對緩慢，直到28 d兩端骨髓腔未能連接。根據Lane-Sandhu〔4〕組織學評分法，對各組組織學光鏡下所見進行組織學評分，見表1。

表1 Lane-Sandhu組織學檢查評分(x±s)

2.2 骨痂VEGF免疫組織化學檢測 各標本內均檢測到VEGF陽性表達。①VEGF在生理鹽水組中陽性表達于血管內皮細胞、骨細胞、骨膜血管內皮細胞，骨祖細胞及成軟骨細胞，細胞數量少，骨祖細胞出現晚，未見骨小梁出現。②VEGF在三七對照組中陽性表達于血管內皮細胞、骨祖細胞及成軟骨細胞，細胞數量較多，骨祖細胞出現較早，可見骨小梁出現，并見骨小梁周圍有血管內皮細胞及骨細胞。③VEGF在接骨湯組中陽性表達于血管內皮細胞及成軟骨細胞，細胞數量多，骨小梁較早出現，并見骨小梁排列致密，骨小梁周圍有大量血管內皮細胞、骨細胞及成骨細胞。見圖1。

圖1 各組骨病VEGF的免疫組化檢測(×400)

2.3 九仙羅漢接骨湯對VEGF表達的影響 接骨湯組與三七對照組中VEGF的MOD在骨折愈合21d時比較差異有統計學意義(P＜0.05);提示接骨湯組與三七對照組在治療第14 d時促進VEGF的合成和分泌高于生理鹽水組(P＜0.05)，兩組中的VEGF的MOD升高貫穿于整個實驗過程，并有促進骨細胞成熟，加速骨折愈合的過程，見表2。

表2 各組各時點VEGF平均光密度值(x±s，n=10)

3 討論

骨折愈合是指骨折端之間再連接的修復過程可以重新形成與原骨的外形、結構及其功能一樣的新骨〔5〕。骨再生是骨修復過程中的重要環節，任何形成的骨再生過程必須依賴于充足的血液供應〔6〕。

VEGF最重要的生物學活性就是特異地作用于內皮細胞，促其增殖和生長血管〔7〕。研究證實VEGF在骨形成和代謝中的作用主要是通過促血管生成參與骨發育形式〔8，9〕，VEGF可特異性作用于血管內皮細胞，最強的促血管生成因子〔10〕。促進其增殖和血管生成，決定血管形成的量與時間，并可增加血管通透性〔11〕。VEGF在骨折愈合初始期表達較弱，主要在骨細胞內;在血管生成和軟骨形成期、軟骨鈣化期及軟骨消散期，隨著骨折的修復，肉芽組織長入血腫，軟骨細胞及成骨細胞侵入發生軟骨內骨化及膜內骨化，在這一階段，組織修復耗氧，骨折局部低氧張力強烈誘導VEGF表達〔7〕。外源性VEGF作用下，局部血管形成增多，血流豐富，帶來了大量促進骨折愈合的生物因子，促進骨折斷端微血管新生增殖，使骨折斷端血循環重建及成骨過程加快，從而加快了成骨速度，縮短骨折愈合時間。創傷骨折后折端VEGF表達貫穿于骨折愈合的全過程，骨折愈合的不同階段，骨痂組織內出現程度不同的VEGF高表達，其表達規律與骨折端血管再生重建呈正相關〔12～14〕。

任何骨折靠其自身的機體免疫反應都會有自然愈合的傾向，但影響骨折愈合的因素眾多〔15，16〕，適宜的藥物干預能大大縮短骨折的愈合進程〔17〕。九仙羅漢接骨湯對骨折的愈合有良好的促進作用，促進骨痂生長，縮短骨折愈合時間。

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