β淀粉樣蛋白1～42促進U87細胞凋亡作用的研究

申茉函 王全才

(中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110004)

阿爾茲海默病(AD)又稱老年性癡呆，其主要病理特征是細胞外老年斑的形成和細胞內神經纖維纏結的集聚，而β淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，在老年斑的形成過程中具有神經元毒性，其作用依賴于多肽的聚集狀態與蛋白濃度，主要的毒性片段是Aβ1～42，是AD的主要致病原因。本文通過MTT檢測代謝率，倒置顯微鏡、投射電鏡以及流式細胞術技術研究Aβ1～42對U87細胞的損傷作用機制，觀察其損傷細胞的途徑，討論AD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 U87細胞(中國醫科大學基礎醫學院);重組人β淀粉樣蛋白1～42(rhAβ1～42)本實驗室制備并純化;DMEM培養基，自購自Gibco公司;Hoechst33342/PI染色試劑盒購自南京凱基生物技術公司;流式細胞儀為美國BECTON DICKINSON公司生產的FACScan。

1.2 細胞培養 U87細胞置于含10%小牛血清的DMEM高糖培養基，培養條件為37℃、5%CO2濕化培養箱中培養。0.25%的胰酶消化后分瓶傳代。rhAβ1～42的處理，用10 mmol/L的HCl使其終濃度為100μmol/L，37℃孵育24 h。

1.3 MTT試驗 細胞生長至約80%鋪滿表面時，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%小牛血清的相應培養液制成單細胞懸液，細胞濃度調整為6×106/ml。每孔100μl接種96孔培養板中，培養 24 h，再向培養液中分別添加 0.5，1，5，10，20 和50 μmol/L的 Aβ1～42，每個濃度組復 4 孔，每孔加入 5 g/L 的MTT 20μl，于37℃培養箱中培養4 h后，吸出上清液，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使細胞溶解，用酶標儀于570 nm波長處測定各孔吸光度A值，計算U87細胞對藥的生長抑制率。

細胞生長抑制率(%)=〔1－實驗組A值/對照組A值〕×100%。

1.4 形態學觀察 取對數生長期的U87細胞，向培養液中加入10μmol/L的Aβ1～42，以未加者為對照組，培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察。

1.5 透射電鏡 Aβ1～42(10μmol/L)與U87細胞共培養，37℃孵育24 h后，對照組加入至與實驗組等體積的培養液。收集細胞，PBS洗3次，離心，沉淀用4%戊二醛固定，4℃放置2 h。1%鋨酸在4℃固定1 h;棄去鋨酸培養液，PBS洗2次，每次20 min。0.5%醋酸雙氧鈾預染，室溫，搖床過夜。30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇脫水各15 min，最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min。Epon812環氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片。1%醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察，拍照。

1.6 細胞凋亡的檢測 細胞培養和固定。將細胞接種于培養皿中，濃度為 5×106/ml，分 5 組，Aβ1～42的終濃度分別為 10、20和50μmol/L，24 h后0.25%胰酶溶液消化、收集細胞、離心，PBS洗2次，按試劑盒說明書加入試劑Hoechst33342和PI，4℃避光孵育1 h后流式細胞儀檢測凋亡細胞比率，使用CELL Quest軟件獲取細胞信息，Winmdi軟件分析細胞凋亡。每組設3個平行孔，并重復3次，另設空白對照組。

1.7 統計學分析 應用SPSS軟件，采用t檢驗進行統計學分析，結果以x±s表示。

2 結果

2.1 rhAβ1～42對U87細胞生長的影響 在0.5～50μmol/L的濃度內，Aβ1～42對U87細胞的生長抑制率明顯上升，細胞毒性作用顯著增強，說明隨著劑量的增大Aβ1～42對細胞的生長抑制效應更加明顯，特別當 Aβ1～42濃度≥10 μmol/L 時，Aβ1～42對U87細胞的生長抑制率明顯高于對照組(P＜0.01)。見圖1。

2.2 投射電鏡觀察 正常對照組細胞表面有微絨毛，核大，內質網，線粒體和高爾基體等結構清晰可見(圖2A);而在實驗組，加入10μmol/L rhAβ1～4224 h后，電鏡下可見細胞核移位、染色質凝聚呈團塊狀，胞質相對較多，核小，核形相對規則，可見粗面內質網、線粒體、滑面內質網，擴張形成池內間隔(圖2B，2C)。

圖1 rhAβ1～42對U87細胞的生長抑制率

圖2 投射電鏡觀察rhAβ1～42對U87細胞形態的影響(×100)

圖3 rhAβ1～42對 U87 細胞形態的影響(×100)

圖4 流式細胞儀檢測各組凋亡率

2.3 rhAβ1～42對 U87細胞形態的影響 倒置顯微鏡下觀察rhAβ1～4210μmol/L劑量組，在培養24 h后可見細胞體積縮小，胞質濃縮，細胞間連接疏松、間質變大，細胞皺縮，部分細胞脫落，與對照組比區分明顯。同時具有上述形態特征的細胞隨作用時間和濃度的增加而增多。見圖3。

2.4 流式細胞儀檢測Aβ1～42對U87細胞的影響 見圖4，圖5。在Aβ1～42濃度為10、20和50μmol/L作用后，流式細胞儀檢測結果表明，10、20和50μmol/L劑量組的凋亡率分別為35.6%，42.2%，58.1%，明顯高于陰性對照組(P＜0.01)，且隨濃度呈正向依賴關系。

圖5 流式細胞儀檢測Aβ1～42對U87細胞的作用

3 討論

科學研究表明，導致人類AD的主要物質是Aβ。AD的診斷標志是神經元丟失、淀粉樣蛋白沉積物(老年斑)、神經纖維纏結(NFTs)，其中老年斑的主要成分是 β 淀粉樣蛋白〔1，2〕，但還未被定義為AD的發病機制和病因。目前，在AD發病機制的眾多假說中，最受關注的淀粉樣蛋白級聯假說認為，Aβ在AD發病過程中起著核心作用〔3，4〕，其引起的一系列神經毒性作用是導致神經細胞功能紊亂和死亡，引發癡呆的主要原因〔5～8〕，故本研究采用 Aβ 為研究對象。

APP是一種Ⅰ型膜蛋白，研究者對在AD腦中表達野生型APP的神經病理學作用還不十分清楚。一些研究發現〔9〕由腺病毒介導的野生型APP695過表達在小鼠海馬部位時可導致神經元的嚴重變性。在一些APP聚集的神經元內表達激活的Caspase-3，呈現典型的凋亡樣特征，如大量的膜泡及DNA片段的形成。這些研究均提示內源性APP在凋亡的神經元內可能被上調，它的過表達通過凋亡途徑誘導神經元變性。同時，作為Caspase-3介導的死亡通路中內源性激活劑而促進凋亡的發生。APP促進細胞凋亡的機制可能還有〔10〕:①APP與Aβ結合通過誘導APP構型發生改變(APP正常功能的喪失)，使APP具有毒性而啟動細胞死亡;②APP通過與接頭蛋白Fe65和X11的結合或通過與G蛋白結合轉導原凋亡信號;③過表達或突變APP明顯增加由谷氨酸介導誘導的原代培養的海馬神經元Ca2+濃度，APP錯義突變將增強其原凋亡活性，使神經元對各種凋亡刺激異常敏感;④APP過度在神經元膜上積累，直接或間接地與神經元特異通道及受體相互作用，可致神經細胞的存活環境失去完整性，同時增加的Aβ對神經元導致的毒性作用，共同誘導細胞凋亡。

U87細胞屬于神經膠質瘤細胞，與神經元細胞有一定的相似之處。它廣泛應用于研究離子通道、受體、遞質分泌的實驗中，也是研究神經毒性常用的細胞株，用于研究多種神經系統疾病〔9～12〕。MTT代謝率實際上反映線粒體內膜琥珀酸脫氫酶的活性，即反映線粒體的功能〔13〕，MTT代謝率降低。說明細胞存活率降低，本研究采用 MTT法，繪制不同濃度 rhAβ1～42對U87細胞生長曲線，結果說明隨著劑量的增大Aβ1～42對細胞的生長抑制效應更加明顯，特別當 Aβ1～42濃度≥10μmol/L時，Aβ1～42對U87細胞的生長抑制率明顯高于對照組。倒置顯微鏡下觀察rhAβ1～4210μmol/L劑量組，在培養24 h后可見細胞體積縮小，胞質濃縮，細胞間連接疏松、間質變大，細胞皺縮，部分細胞脫落。而且具有上述形態特征的細胞隨作用時間和濃度的增加而增多。

本實驗采用流式細胞儀檢測，用凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染法〔14〕。熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst33342比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高。此外，凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變，從而使該染料能更有效地與DNA結合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。PI染料不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。根據這些特性，用Hoechst33342結合PI染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現分別為:正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst33342+/PI+)，凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst33342++/PI+)，壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。在Aβ1～42濃度為10、20和50μmol/L作用后，流式細胞儀檢測結果表明，各劑量組的凋亡率與對照組比較差異顯著，且隨濃度呈正向依賴關系。神經病理學研究提示，與正常人相比，AD患者腦中神經元的凋亡率要高出30～50倍，大多數學者認為凋亡與壞死的發生有賴于藥物的劑量，相反意見認為Aβ導致的細胞損傷完全是由于壞死途徑參與〔15～20〕。

本實驗發現，Aβ1～42對U87細胞的損傷主要是通過凋亡途徑，我們認為當 Aβ1～42濃度過大時，Aβ1～42對 U87 細胞的損傷也可通過壞死途徑，盡管我們認為凋亡是其主要的損傷途徑。

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