煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉移酶1基因對體外原代培養神經元軸突發育的影響

趙 虹 張驚宇 車守梅 赫丹丹 郭朝暉

(哈爾濱醫科大學附屬四院神經內科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目前如何預防和治療神經退行性疾病已成為亟待解決的問題。神經元缺失、軸突變性是多種神經退行性疾病的一個重要特征。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉移酶NMNAT是一類功能尚不完全明確的酶類，該類蛋白質在中樞神經系統和外周神經系統中大量表達。NMNAT1催化NAD的合成〔1，2〕。NAD在所有活細胞的新陳代謝中起關鍵作用，尤其是在中樞神經系統中作為輔酶參與大量轉移反應〔3〕，NMNAT1在NAD合成途徑中是主要酶〔4〕，軸突變性被認為是中樞神經系統變性疾病的新的治療靶點，而且沃勒變性是軸突變性的自我損傷過程，往往發生在軸突損傷或神經元變性時，例如帕金森病(PD)或阿爾茨海默病(AD)〔5～7〕，沃勒變性的軸突由 NMNAT1促使 NAD 的合成得到保護〔8〕，已有研究表明在果蠅中過表達NMNAT1基因卻能夠顯著抑制和延緩軸突的退化〔9〕。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物 原代培養皮層神經元來源于ICR小鼠(SLAC.CHINA)的胚胎，動物實驗保護協議由哈爾濱醫科大學附屬第四醫院動物倫理委員會批準。煙酰胺轉磷酸核糖基酶抑制劑FK-866購置于美國Cayman化學制品公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA構建 編碼小鼠NMNAT1基因的cDNA從小鼠腦cDNA庫中經PCR擴增得到的，所用引物:5'-ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA-3'和5-TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG-3'，并克隆到 PIRES2-EGFP載體(Invitrogen公司)中產生野生型過表達NMNAT1(NMNAT1-OE)序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成 專門針對小鼠NMNAT1 mRNA三個非重疊序列設計后構建到H1啟動子RNAi載體上(psuper，Oligoengine，USA)。最有效的 19-核苷酸靶序列是 5'-ACGAGTGGATCACCAATGA-3'(KD-shRNA)。非特異性對照寡核苷酸設立為無關序列作為對照，該序列為:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(Scr-shRNA)，含干擾序列的寡核苷酸在DNA合成過程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位點。所有序列均被測序證實正確。

1.2.3 原代神經元的培養和轉染 原代新皮層神經元來源于剛出生小鼠(PO小鼠)的胚胎，簡而言之，分離新皮層組織，在4℃含6%葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10 min，并且在補充了B27添加劑 (Invitrogen)0.5 mmol/L左旋谷氨酸和20 mmol/L HEPES的無血清培養基中輕輕磨碎分離，pH7.4在體外培養3～6 d后，神經元用于形態學實驗研究。培養的神經元通過電穿孔的方法轉染。簡單地說，一個包含質粒，電穿孔緩沖物和神經元的混合物移到一個容器中，用轉染試劑盒通過電穿孔技術轉染。

1.2.4 免疫印記分析 神經元溶解在細胞溶解緩沖液中，(10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、140 mmol/L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚)，包含蛋白酶抑制劑的混合物中1 h，離心10 min，以合適的SDS-PAGE膠進行蛋白電泳，轉移到PVDF(Millipore)膜上，用封閉液稀釋一抗，將已封閉的膜置于一抗溶液中4℃過夜，然后放入用辣根過氧化物酶標記的二抗中孵化(1∶5 000;Jackson Immuno Research)，細胞膜用熒光檢測試劑(GE，USA)檢測，小鼠的單克隆抗體和小鼠的抗β-actin抗體分別來自于Santa cruz(sc-30842)和Chemicon(MAB1501)。

1.2.5 免疫細胞化學 細胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS緩沖液中，用5%BSA和0.2%Triton-100在PBS緩沖液中封閉和透化后，細胞在一抗中4℃孵化一夜，然后細胞用Alexa488和Alexa568共軛二抗在室溫下清洗孵化1 h。小鼠單克隆抗-Taul(MAB2239)和小鼠單克隆抗體Map2(AB5622)購置于Chemicon。

1.2.6 成像和圖像分析 膠片在熒光顯微鏡下掃描(尼康，日本)，分析神經突的延長和分支，關鍵是能夠成像一個單一神經元的全部過程，并能區別它們是軸突還是樹突，對成像軸突，需要使用相對低功率放大(20×)獲得圖像，包括神經元的成像。被轉染的細胞用綠色熒光GFP和軸突特異性標記Tau-免疫雙標神經元軸突。Neurolucida軟件用來分析軸突的生長，并且計算軸突的長度。

1.3 統計學方法 使用prism5.0軟件進行單因素方差分析以及 post-hoct-test。

圖1 在原代培養神經元中NMNAT1基因的RNA干擾與過表達

圖2 在培養神經元中NMNAT1對軸突形態的影響

2 結果

2.1 小鼠NMNAT1 shRNA和過表達載體在培養的神經元中有效構建 為了研究NMNAT1在中樞神經系統發育中的功能，設計了一個短發卡RNA(shRNA)的針對小鼠NMNAT1 mRNA的shRNA結構(NMNAT1KD-shRNA)，設計了無針對性對照的shRNA(NMNAT1Scr-shRNA)，把每個shRNA結構轉染原代培養的神經元，檢驗敲除內源性NMNAT1蛋白的能力，Western印跡分析顯示NMNAT1-OE高表達NMNAT1(6.31±0.24)而KD-shRNA有效敲除了 NMNAT1基因(0.21±0.13，圖1)，而 ScrshRNA沒有影響到NMNAT1表達(1.71±0.21)。這些結果證明小鼠NMNAT1過表達和干擾慢病毒載體構建在原代培養小鼠神經元中是有效的。

2.2 NMNAT1對培養鼠神經元軸突形態的調節 如圖2所示，用NMNAT1-OE或KD-shRNA病毒載體轉染了DIV0神經元，并用GFP和軸突特異標志Tau1免疫雙標DIV0神經元。過表達和敲除NMNAT1在軸突的總長度和分支上顯示出顯著的作用(圖2)，上調NMNAT1促進軸突的生長和分支，而下調NMNAT1則有相反的作用，沒有影響神經元的極性。添加2 nmol/L FK-866在體外也阻滯了軸突的生長，這和下調NMNAT1的數據一致，結果顯示在培養的皮層神經元中操縱NMNAT1的表達對軸突的生長有重要作用。見表1。

表1 在培養神經元中NMNAT1對軸突形態的影響(x±s)

3 討論

本研究發現與轉染了Scr-shRNA的神經元比較，敲除了NMNAT1的shRNA引起了軸突分支的顯著減少以及總長度的減少。而且過表達NMNAT1促進了軸突的生長，這與過去報道的培養的脊髓背根神經節的神經元相一致〔7〕。軸突在神經元聯絡時發揮了至關重要的作用，改變軸突結構可能會影響信息的傳播過程，如學習和記憶〔10，11〕。本研究結果表明 NMNAT1這個神經退行性疾病的相關蛋白在大腦中高水平表達，在體外培養的大腦皮層神經元中參與促進軸突生長和復雜度的形態變化，提示NMNAT1在神經元形態發生和神經退行性疾病中的一個重要作用。

一項在果蠅的研究表明NMNAT1是作為一個伴護蛋白而起作用〔11，12〕，關于華勒氏變性的幾項研究顯示 NMNAT1的NAD 合成活動需要它對軸突的保護作用〔11，13～16〕，然而對于中樞神經元，尤其是神經元經歷變性的過程時NMNAT1是否作為一個保護蛋白或酶而發揮功能知道的很少。因此，在不同的變性過程中，NMNAT1的不同功能特征將幫助理解它在神經退行性疾病中的作用。本研究結論是第1次展示了NMNAT1在中樞神經系統軸突中所起的作用，已經為研究人員開發了一實驗性的實驗，在原代培養神經元中通過檢測軸突形態去研究不同刺激下NMNAT1的保護作用。

綜上所述，本實驗闡明了NMNAT1基因的表達水平與神經退行性疾病造成神經元缺失的潛在關系，將為進一步尋找可能的神經退行性疾病的潛在藥物靶點奠定基礎。

1 Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Enzymology of NAD+homeostasis in man〔J〕．Cell Mol Life Sci，2004;61(1):19-34.

2 Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Structure and function of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase〔J〕．Curr Med Chem，2004;11(7):873-5.

3 Berger F，Lau C，Dahlmann M，et al.Subcellular compartmentation and differential catalytic properties of the three human nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase isoforms〔J〕．J Biol Chem，2005;280(43):36334-41．

4 Lau C，Niere M，Ziegler M．The NMN/NaMN adenylyltransferase(NMNAT)protein family〔J〕．Front Biosci，2009;14(4):410-31.

5 Zhai Q，Wang J，Kim A，et al.Involvement of the ubiquitin-proteasome system in the early stages of wallerian degeneration〔J〕．Neuron，2003;39(2):217-25.

6 Zhai RG，Rizzi M，Garavaglia S.Nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，new insights into an ancient enzyme〔J〕．Cell Mol Life Sci，2009;66(17):2805-18.

7 Zhai RG，Zhang F，Hiesinger PR，et al.NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration〔J〕．Nature，2008;452(7189):887-91.

8 Sasaki Y，Vohra BPS，Lund FE，et al.Nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase-mediated axonal protection requires enzymatic activity but not increased levels of neuronal nicotinamide adenine dinucleotide〔J〕．J Neurosci，2009;29(17):5525-35.

9 Zhang T，Berrocal JG，Yao J，et al．Regulation of poly(ADP-ribose)polymerase-1-dependent gene expression through promoter-directed recruitment of a nuclear NAD+synthase〔J〕．J Biol Chem，2012;287(15):12405-16.

10 Wang J，Zhai Q，Chen Y，et al.A local mechanism mediates NAD-dependent protection of axon degeneration〔J〕．J Cell Biol，2005;170(3):349-55.

11 Kandel ER，Schwartz JH，Jessell TM.Principles of neural science〔M〕．New York:McGraw-Hill Companies，Inc，2000:93-4.

12 Zhu Y，Zhang L，Sasaki Y，et al.Protection of mouse retinal ganglion cell axons and soma from glaucomatous and ischemic injury by cytoplasmic overpression of Nmnat 1〔J〕．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013;54(1):25-36．

13 Watts RJ，Hoopfer ED，Luo L.Axon pruning during Drosophila metamorphosis:evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system〔J〕．Neuron，2003;38(6):871-85.

14 Yan T，Feng Y，Zheng J，et al.Nmnat 2 delays axon degeneration in superior cervical ganglia dependent on its NAD synthesis activity〔J〕．Neurochem Int，2010;56(1):101-6.

15 Luo L，O'Leary DD.Axon retraction and degeneration in development and disease〔J〕．Annu Rev Neurosci，2005;28(1):127-56.

16 Coleman M.Axon degeneration mechanisms:commonality amid diversity〔J〕．Nat Rev Neurosci，2005;6(11):889-98.