轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-2在顳葉癲癇模型小鼠海馬的表達(dá)變化

李 艷 趙旭東

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331)

顳葉內(nèi)側(cè)癲癇(MTLE)是指顳葉內(nèi)側(cè)海馬病變導(dǎo)致的癲癇(EP)，臨床主要表現(xiàn)為復(fù)雜部分性發(fā)作，病理以海馬硬化為典型特征。目前，EP的發(fā)病機(jī)制尚不清楚〔1〕。在EP動(dòng)物模型中存在明顯神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是EP重要發(fā)病機(jī)制〔2〕。然而，EP神經(jīng)細(xì)胞凋亡原因尚不清楚。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-2(AP-2)對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡具有重要作用〔3，4〕。AP-2表達(dá)對(duì)細(xì)胞生存具有雙重作用，其過低或過高表達(dá)都可引起細(xì)胞凋亡。因此，我們推測(cè)EP發(fā)病可能與AP-2異常表達(dá)從而進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察了海人酸(KA)側(cè)腦室注射誘導(dǎo)的EP小鼠海馬AP-2表達(dá)，對(duì)AP-2在EP發(fā)病機(jī)制中所起作用進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(32只)，健康雄性，體重22～25 g。在溫暖(20～24℃)，相對(duì)濕度40% ～70%，自由進(jìn)食和飲水。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為模型組和對(duì)照組兩組。模型組再按照不同處死時(shí)間分為造模后3 h、8 h、24 h，每組8只。KA(Sigma公司)，兔抗小鼠AP-2抗體(AP-2;Santa Cruz公司)，生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司)，腦立體定向注射儀(深圳瑞沃德有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備EP模型 首先使用水合氯醛(3.6%，360 mg/kg)腹腔注射，小鼠麻醉后固定小鼠頭部于立體定向儀。去毛、消毒，切開頭皮以使前囟暴露。根據(jù)小鼠腦立體定向圖譜在相應(yīng)部位(前囟后0.4 mm，右側(cè)旁開1.3 mm)鉆一圓孔直徑為1.0 mm，深度達(dá)硬腦膜表面。通過微量進(jìn)樣器，注入1μl KA(0.1μg/μl)，4 min內(nèi)勻速注射完，然后留針4 min后用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合小鼠皮層，后進(jìn)行EP行為學(xué)觀察。依據(jù)Racine分級(jí)〔5〕判斷EP發(fā)作程度，Ⅲ級(jí)以上為成功動(dòng)物模型。而對(duì)照組則采用等體積生理鹽水代替KA進(jìn)行側(cè)腦室注射，操作方法相同。手術(shù)后3 h、8 h、24 h進(jìn)行取材。

1.2.2 RT-PCR方法檢測(cè)AP-2 mRNA表達(dá) 小鼠手術(shù)后3 h、8 h、24 h分別斷頭取出腦組織，分離出海馬，使用Trizol法(Trizol試劑盒，天根公司)，提取組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 10 min，30℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 4 min。以引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier5.0設(shè)計(jì)AP-2、內(nèi)參GAPDH，由上海生工生物公司合成。AP-2上游引物:5'ACTATCGGCGGCACGAGGAC 3';AP-2下游引物:5'TGGCGTGAGGTAAGGAGTGG 3';擴(kuò)增片段為90 bp;GAPDH上游引物:5'TGCCCAGAACATCATCCC 3';GAPDH上游引物:5'AAGTCGCAGGAGACAACC 3';擴(kuò)增片段為252 bp;PCR循環(huán)條件為:94℃ 預(yù)變性2 min，94℃ 變性30 s，60℃退火30 s，取5μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。1μl DNA樣本作為PCR擴(kuò)增模板，陰性對(duì)照擴(kuò)增模板為去離子水;擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min;隨后95℃ 15 s，退火溫度15 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸5 min。使用加權(quán)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行灰度值對(duì)比。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)AP-2蛋白表達(dá)情況 小鼠手術(shù)后分別于3 h、8 h、24 h斷頭取出腦組織，分離出海馬組織，將海馬組織沖洗干凈并且置于2 ml的勻漿器中預(yù)先加入1 ml蛋白提取緩沖液、蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)，冰上研磨，收集研出液。放在冰上孵育15 min以后，置于4℃離心機(jī)、離心10 min，吸取上清并分裝，放置在－80℃中保存。將蛋白樣本和5×SDS上樣液充分混合后，100℃煮沸7 min，冷卻后加入上樣孔(20μl/孔)，120 V 恒壓電泳約 1.5 h，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜 100 mA，22 min、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗兔抗小鼠AP-2抗體(1∶1 000)，4℃冰箱過夜，TBST清洗后，加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記(1∶4 000)，室溫孵育，2 h。TBST洗滌 PVDF膜，最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)進(jìn)行曝光。采用Bio-rad化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行分析、采集。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)AP-2在海馬表達(dá)水平 模型小鼠手術(shù)后分別于3 h、8 h、24 h斷頭取出腦組織，4%多聚甲醛緩沖液固定24 h后，用石蠟包埋，在視交叉前端大腦和背側(cè)海馬處連續(xù)切片，切片厚度為10μm。石蠟切片依次脫蠟、脫水、再加入3%過氧化氫10 min，PBS清洗、胰酶37℃硝化30 min，PBS清洗，BSA室溫封閉30 min，甩去余液加入兔抗小鼠AP-2抗體單克隆抗體(Santa cruz，USA)(1∶100)，4℃過夜。PBS 清洗、加入生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司，SABC)，37℃孵育40 min，滴加SABC37℃孵育40 min，DAB顯色，室溫5～10 min，用顯微鏡觀察染色變化。判斷染色結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)采用選擇相同區(qū)域、相同條件下用IMAGE軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)AP-2在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)水平 取24 h小鼠模型，斷頭取出腦組織，用4%多聚甲醛液固定24 h，15%和30%蔗糖依次脫水3 h，在視交叉前端大腦和背側(cè)海馬處連續(xù)切片，切片厚10μm。加入5%山羊血清37℃，30 min后甩去血清，加入一抗是兔抗小鼠AP-2抗體單克隆抗體(1∶100，Santa Cruz，USA)和山羊抗小鼠 NeuN(1 ∶200，Millipore)，4℃過夜。第2天分別使用CY5，F(xiàn)ITC二抗(1∶100，北京中杉公司)，37℃，40 min，再加入 DAPI，37℃，5 min，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察與采圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)觀察結(jié)果 模型組小鼠側(cè)腦室注射KA于3 h后明顯出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的面部抽搐、身體背曲、肢體陣攣、陣發(fā)性旋轉(zhuǎn)、尾部翹起、跌倒站立等EP發(fā)作表現(xiàn)。每次發(fā)作時(shí)間10余秒，呈間歇性反復(fù)發(fā)作狀態(tài)。在8 h后逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)，并且24 h仍有發(fā)作，主要以Ⅱ～Ⅲ級(jí)發(fā)作。對(duì)照組小鼠無上述EP發(fā)作的癥狀。

2.2 EP發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間RT-PCR檢測(cè)AP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 圖1顯示，AP-2條帶位于90 bp左右，與預(yù)期產(chǎn)物大小保持一致。術(shù)后3 h、8 h、24 h，EP小鼠海馬AP-2表達(dá)具上升(0.459 8±0.025 59、0.845±0.025 91、0.675±0.03，P＜0.05)，其中術(shù)后8 h 時(shí)表達(dá)最高(0.255 6±0.027 57，P＜0.01)，術(shù)后24 h時(shí)趨于降低，但是仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)基因AP-2在各組小鼠海馬的表達(dá)

2.3 EP發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Western印跡檢測(cè)AP-2蛋白表達(dá) AP-2條帶位于48 kD左右，和預(yù)期產(chǎn)物大小保持一致。術(shù)后癲癇小鼠分別在3 h、8 h、24 h海馬組織 AP-2表達(dá)具上升(0.395 4±0.024、0.891±0.068、0.63±0.011，P＜0.05)，其中術(shù)后8 h時(shí)表達(dá)最高(P＜0.01)，術(shù)后24 h時(shí)趨于降低，但是仍高于對(duì)照組(0.154±0.011，P＜0.05)，見圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)蛋白AP-2在各組小鼠海馬的表達(dá)

2.4 EP發(fā)作小鼠以及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化檢測(cè)AP-2在海馬表達(dá)水平 在對(duì)照組海馬中有較少棕黃色顆粒沉積，說明在正常海馬細(xì)胞內(nèi)AP-2表達(dá)較少，但是在模型組海馬則有大量棕黃色顆粒沉積，因此AP-2在EP小鼠海馬表達(dá)增加，AP-2主要表達(dá)主集中在海馬CA1的區(qū)域，尤其是在手術(shù)8 h后海馬組織有大片棕黃色顆粒沉積。免疫組化的結(jié)果證明AP-2在手術(shù)8 h后EP小鼠海馬AP-2表達(dá)是最高。其余各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異。見圖3。

2.5 EP發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)AP-2在海馬表達(dá)水平 免疫熒光組織染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在海馬CA3區(qū)中，AP-2在胞核中與胞質(zhì)中均有表達(dá)，并且可以在NeuN(為神經(jīng)元的特異標(biāo)記物)中可見有共表達(dá)發(fā)生，說明海馬神經(jīng)元可以分泌AP-2蛋白。見圖4。

圖3 AP-2在各組小鼠海馬CA1區(qū)的免疫組化表達(dá)(×400)

圖4 AP-2與NeuN在EP24 h小鼠海馬CA3區(qū)的共表達(dá)(×400)

3 討論

由于EP發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，目前的抗EP藥都是控制EP癥狀的發(fā)生，長(zhǎng)期治療效果不佳。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短暫或持續(xù)的EP發(fā)作可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡和多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如凋亡調(diào)節(jié)蛋白、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族成員等〔6〕。Akcali等〔7〕在顳葉 EP 動(dòng)物模型海馬CA1區(qū)檢測(cè)到編碼Bax、Bcl-2蛋白的mRNA呈異常表達(dá);Lee等〔8〕在紅藻氨酸鹽誘導(dǎo)的EP模型海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了早期即刻基因的大量表達(dá)，如c-Jun、c-fos，并通過免疫組化定量分析，及用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，證實(shí)早期即刻基因的表達(dá)與凋亡細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)。然而，EP患者細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。

AP-2轉(zhuǎn)錄因子是一種特殊序列的DNA結(jié)合蛋白，可以與誘導(dǎo)病毒和細(xì)胞增強(qiáng)元件相互作用，刺激基因有選擇的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中有4類AP-2基因被確定，它們是AP-2α、AP-2β、AP-2γ和AP-2δ，所有類型的AP-2都具有激活轉(zhuǎn)錄的能力，雙向調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)〔9〕。已知AP-2激活的基因有細(xì)胞周期抑制因子 p21，WAF/CIP、TGF2α、c2KIT、Ⅳ型膠原酶、SV40 增強(qiáng)、人類金屬硫蛋白基因Ⅱa、ER、IGFBP 25、HER22/neu癌基因等。AP-2負(fù)性調(diào)節(jié)的基因，包括MCAM/MUC18、原癌基因c2Myc、c2EBP2α等〔9〕。AP-2通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，影響細(xì)胞生命活動(dòng)、細(xì)胞間穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育等。

本實(shí)驗(yàn)說明AP-2高表達(dá)與EP發(fā)病可能具有密切關(guān)系。目前研究表明，許多介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、形成和聯(lián)系的基因，一般都具有AP-2結(jié)合位點(diǎn)和順式調(diào)控序列〔10〕。AP-2表達(dá)異常可引發(fā)細(xì)胞凋亡，也可引發(fā)癌癥等疾病。另外，AP-2還參與調(diào)節(jié)了乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶、烯醇化酶、突觸蛋白、早老素2、腦啡肽原和兒茶酚胺合成酶等多種神經(jīng)相關(guān)基因的調(diào)控〔11〕。因此，AP-2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活及神經(jīng)系統(tǒng)功能具有重要作用。AP-2異常表達(dá)可能引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。本文推測(cè)，EP患者AP-2表達(dá)上升，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步誘發(fā)了EP發(fā)病。

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