紅景天苷誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制

宋漢君 呂少春 李麗疆

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

紅景天苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗疲勞、抗抑郁等作用〔1～3〕。研究顯示，紅景天苷能抑制肝癌細(xì)胞(HepA)增殖，具有提高特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和非特異性殺傷細(xì)胞(NK)的活性〔4〕，但尚未進(jìn)一步研究紅景天苷抗腫瘤作用機(jī)制。本試驗(yàn)旨在分析紅景天苷誘導(dǎo)小鼠HepA肝癌細(xì)胞凋亡和作用機(jī)制，對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)進(jìn)行測(cè)定，為紅景天苷的抗癌機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 蘇木精、伊紅購(gòu)于北京中杉金橋生化試劑公司;DNA末端轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒、濃縮對(duì)二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz生物公司;紅景天苷購(gòu)于上海微晶生物試劑公司;環(huán)磷酰胺(CTX)購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 KM普通級(jí)小白鼠30只，雌雄各半，體重(20±2)g，購(gòu)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SLXK(黑)20110001。分籠飼養(yǎng)，每籠10只，室溫(26±2)℃，均食用普通飼料，自由飲水，清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，光照8～10 h/d。HepA荷瘤種鼠，佳木斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠HepA肝癌模型 無(wú)菌條件下取傳代接種的種鼠HepA腹水瘤，以0.9%生理鹽水稀釋至5×106/ml，然后接種于實(shí)驗(yàn)小鼠左腋下，0.3 ml/只。

1.2.2 試驗(yàn)分組及藥物處理 試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，24 h后，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃0.2 ml/只，1次/d;CTX作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組(CTX組)，1次/d，25 mg/kg，腹腔注射;紅景天苷組(Sa組)每只小鼠腹腔注射紅景天苷溶液0.3 mg/d，連續(xù)注射 28 d。

1.2.3 觀察凋亡形態(tài)學(xué)變化 28 d后，脫頸處死各組小鼠，無(wú)菌迅速解剖出各組小鼠腫瘤組織，于甲醛中固定，酒精脫水，石蠟包埋，組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 TUNEL染色 石蠟切片脫蠟水合，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K，PBS漂洗，浸入封閉液，PBS漂洗2次，標(biāo)記反應(yīng)。樣本用濾紙吸干，每個(gè)樣品滴加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)反應(yīng)60 min，PBS漂洗3次，樣品用濾紙吸干。滴加辣根過(guò)氧化酶(HRP)工作液，反應(yīng)30 min，滴加DAB工作液，顯色10 min，PBS漂洗3次，蘇木精復(fù)染，漂洗脫水，鏡下觀察。鏡下棕黃色顆粒即為凋亡細(xì)胞，而藍(lán)色細(xì)胞提示非凋亡細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。選擇5個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) Bcl-2、Bax應(yīng)用免疫組化試劑盒對(duì)Bcl-2和Bax的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。鏡下棕黃色細(xì)胞為蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞為陰性細(xì)胞，計(jì)算5個(gè)隨機(jī)視野陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Origin7.5軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，計(jì)量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)為方差齊性，多組資料采用單因素方差分析，兩組間差異采用Duncan＇s檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 HE染色光鏡下顯示，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，大小不一，形狀各異，胞核大且深染，具有明顯異型性。CTX組和Sa組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，核染色質(zhì)聚于核膜邊緣，核型不規(guī)則，核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，與對(duì)照組相比出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù) TUNEL染色光鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞多染成藍(lán)色，即陰性細(xì)胞。而在CTX組和Sa組出現(xiàn)了更多的棕黃色顆粒。經(jīng)圖像分析，CTX組〔(8.89±0.88)%〕、Sa組〔(20.16±3.14)%〕與對(duì)照組 〔(4.88±0.62)%〕腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 腫瘤細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 CTX組和Sa組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(41.91±7.46，27.47±5.23)，與對(duì)照組(69.50±8.36)差異顯著(P＜0.01)。而 Bax陽(yáng)性表達(dá)經(jīng)過(guò) CTX(43.52±7.45)和 Sa(52.78±9.06)處理后，與對(duì)照組(23.79±4.21)差異顯著(P＜0.01)。見(jiàn)圖3，圖4。

圖1 腫瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化(×400)

圖2 HepA肝癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討論

通過(guò)紅景天苷誘導(dǎo)小鼠HepA肝癌細(xì)胞凋亡的上述系列試驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天苷能誘導(dǎo)小鼠腫瘤組織出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，增加腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目，減少了Bcl-2增加Bax的表達(dá)，這表明紅景天苷抗小鼠HepA肝癌的作用與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色、TUNEL染色提示腫瘤細(xì)胞DNA大量斷裂，證明紅景天苷可誘導(dǎo)小鼠HepA肝癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及多種基因的激活、表達(dá)與調(diào)控，如Bcl-2、半胱胺酸蛋白酶(caspase)、原癌基因(c-myc)、p53 等〔5，6〕。凋亡過(guò)程的紊亂與腫瘤等許多疾病的發(fā)生有直接或間接的聯(lián)系。許多化療藥物如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤的一個(gè)重要策略。

線粒體凋亡途徑和細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑是導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡的兩個(gè)主要途徑。而線粒體凋亡途徑被公認(rèn)為一個(gè)主要的途徑，由Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)(Bcl-2和Bax)，該蛋白在宮頸癌、肝癌、胃癌等腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，紅景天苷可通過(guò)啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，但是否可以在其他動(dòng)物模型或人體中出現(xiàn)同樣的試驗(yàn)結(jié)果目前還未曾可知，這是今后需要進(jìn)一步研究的方向。

圖3 腫瘤組織Bcl-2蛋白的表達(dá)(×100)

圖4 腫瘤組織Bax蛋白的表達(dá)(×400)

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