伏寒顆粒對先天伏寒小鼠模型免疫相關因子的影響

郭家娟 張 爽 李亦男 黃永生

(長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021)

“先天伏寒”理論是黃永生教授基于多年臨床實踐，結合前人伏邪理論，創新性提出的中醫病因學說。經過多年臨床實踐，已經基本完備了先天伏寒證候的診療規范，組方伏寒顆粒應用于臨床，取得了滿意的療效。為深入研究先天伏寒證候，并且使先天伏寒證候及伏寒顆粒的研究更客觀化，本實驗以建立先天伏寒動物模型為基礎，觀察伏寒顆粒對先天伏寒動物模型免疫相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，體重(23±2)g，由吉林大學動物實驗中心提供，合格證號:SCXK-(J)2011-0003。

1.2 實驗藥物 氫化潑尼松注射液(天津藥業焦作有限公司，生產批號:13031011);伏寒顆粒(長春中醫藥大學附屬醫院，批準文號:Z2013A004);金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，生產批號:13030925)。

1.3 試劑盒 大鼠超敏C反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-6、IL-4 酶聯免疫分析ELISA試劑盒，均由上海邦奕商貿有限公司提供。

1.4 實驗儀器 FAIO04電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);酶聯免疫檢測儀(南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司);京立LDZ5-2離心機(北京醫用離心機廠);TH-212智能數字測溫儀(北京鴻鷗成運科技有限公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 腎陽虛模型的建立 4周齡Wistar大鼠48只，隨機數字表法選取38只，雌雄各半為腎陽虛模型組;10只為正常對照組。腎陽虛模型組予氫化潑尼松腹腔注射，每只3.6 mg/100 g，連續14 d。同時附加寒冷因素:將大鼠分別置于2℃ ～4℃的冷水中游泳，每次5 min，1次/d，共14 d。造模完成后，觀察精神狀態、體重、皮毛光澤度、豎毛現象、反應靈敏度、是否喜歡擁擠在一起、大便濕度等一般狀態確定造模是否成功。正常對照組常規喂養。

1.5.2 先天伏寒模型的建立 選取具有典型腎陽虛表現的腎陽虛模型組大鼠20只，另取正常的6周齡Wister大鼠10只，用摸球法隨機平均分配為正常雄加陽虛雌、陽虛雄加陽虛雌、陽虛雄加正常雌各5對，分別同籠產子，得到的子代分別為正常雄加陽虛雌組、陽虛雄加陽虛雌組、陽虛雄加正常雌組，共同組成先天伏寒模型組。

1.5.3 灌胃給藥 先天伏寒模型大鼠常規喂養至4周齡，通過一般狀態觀察，選取具有先天伏寒狀態表現的大鼠，用查隨機數字表法取45只，體重(23±3)g。用摸球法平均分成先天伏寒模型伏寒顆粒組，先天伏寒模型腎氣丸組，先天伏寒模型空白對照組。伏寒顆粒組每日給予伏寒顆粒溶液(濃度10.4%)2.5 ml/100 g灌胃。腎氣丸組每日予以金匱腎氣丸溶液(濃度5.2%)2.5 ml/100 g灌胃，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，共14 d。

1.5.4 觀察指標 各組分別進行一般狀態觀察，口腔及前后爪溫度測定，血清 IFN-γ、IL-4、hs-CRP、IL-6、TNF-α 含量測定。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件計量資料均以x±s表示，多組間兩兩均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組一般狀態表現 先天伏寒模型鼠喂養至4周齡，與同周齡腎陽虛模型鼠比較，體重稍有減輕，皮毛光澤度更差，豎毛現象更加明顯，反應靈敏度更差，更喜歡擁擠在一起相互取暖，飲水量增加，大便濕度更高。

經14 d灌胃治療，先天伏寒模型伏寒顆粒組與先天伏寒模型腎氣丸組在一般狀態表現方面較治療前均有所改善，精神狀態恢復，體重增加，皮毛光澤度改善，反應靈敏度增加，豎毛現象改善，飲水量減少，常喜歡擁擠在一起的現象減少，大便較前干燥。先天伏寒模型伏寒顆粒組較先天伏寒模型腎氣丸組改善更明顯。先天伏寒模型空白對照組未見明顯變化。

2.2 口腔及前后爪溫度測定 先天伏寒模型組口腔及前后爪溫度與正常對照組對比有顯著性差異(P＜0.01)。腎陽虛模型組與正常對照組小鼠比較，后爪(P＜0.01)及口腔和前爪溫度差異均有統計學意義(P＜0.05)。先天伏寒模型組與腎陽虛模型組比較，口腔、前爪溫度(P＜0.01)及后爪溫度均有統計學意義(P＜0.05)。3組先天伏寒模型組口腔、前、后爪溫度對比均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

經過2 w灌胃，與空白組對照對比，伏寒顆粒組和腎氣丸組口腔及前后爪溫度均有回升(P＜0.01，P＜0.05)。伏寒顆粒組口腔及前后爪溫度回升較腎氣丸組明顯(P＜0.05)。見表2。

2.3 免疫指標檢測 與同周齡腎陽虛模型組比較，先天伏寒模型組血清 hs-CRP、IL-6、IL-4、TNF-α 含量增高，IFN-γ 含量、Th1/Th2比值顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);正常雄加陽虛雌組，陽虛雄加正常雌組，陽虛雄加陽虛雌組之間相互比較差異不明顯(P＞0.05)。見表3。

與空白對照組比較，伏寒顆粒組血清hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4含量顯著降低，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值顯著升高(P＜0.01);腎氣丸組血清 hs-CRP、IL-4含量顯著降低(P＜0.01)，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值顯著升高(P＜0.01)，血清TNF-α、IL-6含量降低(P＜0.05)。與腎氣丸組相比，伏寒顆粒組血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 含量，Th1/Th2 比值有差異(P＜0.05)。伏寒顆粒與腎氣丸對先天伏寒模型免疫相關因子均有影響，伏寒顆粒對先天伏寒模型免疫相關因子紊亂狀態的改善優于腎氣丸。見表4。

表1 先天伏寒小鼠與腎陽虛小鼠及正常小鼠口腔、前后爪溫度比較(x±s，n=6，℃)

表2 伏寒顆粒與腎氣丸對先天伏寒小鼠口腔及前后爪溫度的影響(x±s，n=6，℃)

表3 先天伏寒小鼠與腎陽虛小鼠免疫因子比較(x±s，n=6)

表4 伏寒顆粒與腎氣丸對先天伏寒小鼠免疫因子的影響(x±s，n=6)

3 討論

先天伏寒動物模型是以中醫理論為基礎，通過模擬先天伏寒“男女媾精，陽氣不足，寒伏于內”的病因理論來進行造模。先天伏寒于腎是其病因所在，隨著病程的發展，可形成在下的陰寒格陽于上，陽不入陰，其癥狀表現除手足涼、以足涼為主的脾腎陽虛證等真寒之象外，還表現有口干、心煩等假熱之象。本研究用腎陽虛大鼠同籠產子，通過觀察新生鼠一般狀態表現，發現先天伏寒模型大鼠顯現出明顯的“先天伏寒”癥狀，即體重減輕皮毛光澤度差，豎毛現象明顯，反應靈敏度下降，喜歡擁擠在一起相互取暖，大便濕度高等寒象(真寒)，并且較腎陽虛模型鼠嚴重;同時表現有飲水量增加的熱象(假熱)。先天伏寒模型的這種寒熱錯雜表征與先天伏寒證候特點一致。

先天伏寒課題組前期的研究表明，先天伏寒證亞健康人群血清 IL-6、TNF-α水平升高，先天伏寒證候與陽虛證候存在著相似的炎癥因子升高，但先天伏寒證的血清hs-CRP升高更明顯〔1〕。

本實驗研究結果表明，此先天伏寒模型造模方法得到的動物模型較符合先天伏寒證候本質，為進一步探討理想的先天伏寒動物模型提供了理論依據和實踐經驗。先天伏寒證候存在免疫系統紊亂，除先天伏寒課題組前期實驗已經證明的hs-CRP、TNF-α、IL-6 增高外，可能存在 Th 亞群紊亂，以 IFN-γ、Th1/Th2比值降低、IL-4增高為特點。本實驗微觀生物學指標可作為先天伏寒證候進一步研究的參考。

中醫治療的根本原則是“治病求本”，求本是任何疾病實施治療時都應首先遵循的原則。黃永生教授在遵循先賢治病求本理論基礎上，通過對多年臨床經驗的總結，認為先天伏寒證究其根本病性屬陰，病因為先天伏寒于腎，病機特點為“氣(陽)虛氣滯、寒熱錯雜”，寒為陰邪，隨著人體腎氣的衰退，脾腎之陽受損，治療上首要任務為溫補脾腎之陽，同時補益中氣。用仙茅，仙靈脾、巴戟天以溫補脾腎之陽，用黃芪、白術補益中氣、充健脾氣。伏寒于腎，寒盛于下，使陽無宅，逼陽外走，浮躍于上，故在益氣溫陽的同時，還加用苦寒而降的知母、黃柏，引陽歸陰，使真龍歸于腎水，生化無窮。用辛溫發散、醒脾開胃的清夏，暢達氣機升降之路，使肺氣宣降，陰火下行暢達無阻。現今社會紛繁復雜，人們多處在所愿不遂的心理狀態之中，故疏肝理氣法要貫徹治療的始終，應用理氣之品枳殼，合行滯止痛之品青皮以疏肝理氣;最后輔以辛甘之品當歸，補血活血的同時助黃芪以益氣健脾;理氣溫中之品砂仁以疏泄氣機，醒脾開胃。根據以上，黃永生教授立方伏寒顆粒，針對先天伏寒證進行治療，臨床收效明顯〔2〕。

本實驗研究表明，伏寒顆粒對先天伏寒證的療效優于腎氣丸，可有效改善先天伏寒模型免疫因子的紊亂狀態，使血清免疫因子(hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ、Th1/Th2 比值)水平呈正向改變趨勢。以方測證，說明本實驗得到的先天伏寒大鼠模型比較符合先天伏寒證候特點，為進一步研究先天伏寒動物模型提供了理論及實踐參考。

1 崔英子.從“先天伏寒”論治冠心病及其與神經內分泌免疫相關因子關系的研究〔D〕．長春:長春中醫藥大學碩士學位論文，2010:95-111.

2 崔英子，郭家娟，黃永生.從先天伏寒論治冠心病心絞痛126例臨床觀察〔J〕．中醫雜志，2010;51(6):516-9.