神經生長因子和蝮蛇抗栓酶對腦梗死大鼠海馬神經元一氧化氮合酶陽性神經元的影響

張 曄 周酈楠

(遼寧衛生職業技術學院，遼寧 沈陽 110101)

心腦血管疾病具有致殘率高、死亡率高、發病率高的特點，好發于50歲以上的中老年人，已嚴重威脅到人類的身體健康。如今，在我國有2.7億余人患有心腦血管疾病，患病人數還在繼續上升，其中多發性腦梗死(MCI)占的比重最大。因此，對多發性腦梗死發病機制及治療措施的研究在提高患者生活質量等方面發揮了重要作用。本文探討神經生長因子(NGF)和蝮蛇抗栓酯(Svate-3)對MCI大鼠海馬神經元一氧化氮合酶(nNOS)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 注射用神經活素(神經生長因子，NGF)及精制蝮蛇抗栓酶(Svate-3)購于中外合資大連斯威特制藥有限公司;還原型輔酶Ⅱ購于中國國藥集團上海化學試劑有限公司;硝基四氮唑藍及三羥甲基氨基甲烷購于中國上海前進試劑廠。

1.2 動物及分組 雄性Wistar大鼠(由沈陽醫學院實驗動物中心提供)60只。所有大鼠適應性飼養5 d后，隨機分為正常對照組20只、模型組20只及治療組20只。各組在第1天和第7天分別取材10只。

1.3 MCI模型制備 將麻醉(1%戊巴比妥鈉，40 ml/kg)后的大鼠在頸部正中切開、剝離，充分暴露處左側頸內動脈、頸外動脈及其分叉處;用動脈夾對頸總動脈及頸內動脈的遠心端進行無損傷夾閉;用眼科直剪在頸外動脈上剪一小口，逆行插入套管針并固定，拔出針芯，開放頸內動脈處的動脈夾，注入肝素鹽水0.2 ml(含肝素10 IU)以及微小栓子懸濁液0.5 ml(25 g/L);注射完畢后，結扎頸外動脈剪口處的近心端，開放頸總動脈處動脈夾，使栓子通過頸內動脈進入顱內。最后，逐層縫合進行觀察〔1～3〕。

1.4 術后處理 術后模型組用1 ml·100 g－1·d－1生理鹽水灌胃。治療組肌肉注射 NGF 500 BU·ml－1·d－1;尾靜脈注射Svate-3 0.025 U·200 g－1·d－1，連續 7 d。

1.5 神經功能評分 于第1天和第7天進行神經功能評分，參照Longa等〔4〕的神經功能缺損評分標準。

1.6 取材切片 將麻醉(1%戊巴比妥鈉，40 ml/kg)后的大鼠開胸，經升主動脈對大鼠進行內固定灌注(用0.1 mol/L PBS配置的4%多聚甲醛固定液)，結束后，端頭迅速取出腦組織，置入同種固定液中4 h，然后將腦組織切成薄塊，并放置在20%蔗糖溶液中脫水，于4℃冰箱內保存，直至腦組織薄塊下沉，取出作冠狀位連續冰凍切片〔5〕，片厚20μm。

1.7 尼氏染色 冰凍切片自冰箱內取出，室溫晾干，用0.1 mol/L PBS將切片漂洗3次(5 min/次)，然后將切片置于10 g/L的甲苯胺藍溶液中(37℃，90 min)，取出后，用蒸餾水進行沖洗，再用0.1 mol/L PBS將切片漂洗3次(5 min/次)。常規脫水、透明、封片，置于光鏡下觀察。

1.8 NOS免疫組織化學染色 用0.1 mol/L PBS徹底漂洗切片;室溫下，在0.2%TritonX-100 PBS溶液中預孵育10 min;37℃下，在孵育液(NADPH-d 10 mg，NBT 5 mg，Triton X-100 0.03 ml，用 pH=7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩液溶液配置成100 ml)中反應2～3 h;用0.1 mol/L PBS終止反應，并漂洗3次(1 min/次)。常規脫水、透明、封片。利用顯微圖像分析儀，對大鼠海馬CA1區單位面積內形態、結構完整的存活神經元數及nNOS陽性神經元數量進行測定。

1.9 統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗前后體重(g)變化 第1天，各組實驗動物體重無差異。第7天，正常對照組與第1天比較體重略有下降但無顯著差異(P＞0.05);模型組和治療組體重下降明顯(P＜0.01);治療組與模型組比較體重有所增加(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實驗前后體重變化(x±s，n=10，g)

2.2 不同時間點各組大鼠神經功能評分測定 第1天，正常對照組無神經功能的改變;模型組(2.50±1.08)和治療組(2.40±0.70)大鼠均產生不同程度的神經功能障礙(P＜0.01)，但模型組與治療組比較無顯著差異(P＞0.05)。第7天，治療組(1.20±0.92)與模型組(2.30±0.95)相比較有差異(P＜0.05)。模型組第1天與第7天神經功能無明顯差異，治療組第1天與第7天比較有顯著差異(P＜0.01)。

2.3 尼氏染色結果 第1天，正常對照組尼氏染色切片上，大鼠海馬CA1區神經元數量較多，排列緊密并且形態完整、分布均勻，胞質內可見豐富的尼氏體，染色正常。第7天，模型組大鼠海馬CA1區切片上，可見少量神經元存活，有散亂無規則狀的細胞碎片。第1天，模型組與治療組神經元數較正常對照組明顯減少(P＜0.01)。第7天，治療組與模型組比較神經元數量顯著增多(P＜0.01)。治療組與同組第1天比較神經元明顯增多(P＜0.01)，與正常對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區單位面積內神經元數量(x±s，n=10)

2.4 NOS免疫組化結果 正常對照組NOS陽性反應物呈藍色，主要集中在胞質和突起，胞核不著色。第1天，模型組大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元呈圓形或卵圓形的胞體，著色較深，突起較少;治療組大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元數量較模型組少，胞體呈圓形，胞體著色較淺，突起不明顯。第7天，模型組大鼠海馬CA1區切片上，陽性神經元分布稀疏，神經元的胞體呈圓形，胞體著色較淺，突起少;治療組大鼠海馬CA1區切片上可見胞體著色較模型組深，胞體呈圓形或橢圓形，突起可見。第1天，模型組與治療組nNOS陽性神經元數量較正常對照組明顯增多(P＜0.01);治療組與模型組比較nNOS陽性神經元數量減少(P＜0.01)。第7天，模型組與正常對照組比較nNOS陽性神經元數量減少(P＜0.01)，治療組接近正常對照組nNOS陽性神經元數量(P＞0.05)。治療組第7天與第1天比較nNOS陽性神經元數量減少(P＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區nNOS陽性神經元數量(x±s，n=10)

3 討論

一氧化氮(NO)是一種重要血管活性物質，最早在血管內皮細胞中被發現，其有局部血流調節的作用〔6〕，作為一種重要信使分子，雖然NO的化學結構簡單，但它卻能以相對特異的方式參與腦的多種生理病理過程〔7〕。

NO參與中樞神經系統腦組織內的許多生理功能:它能夠促進神經遞質的釋放;參與突觸可塑性的形成;參與了視覺、疼痛及氣味區分;調節了血腦屏障的通透性;參與到學習和記憶過程;還參與到長時程增強(LTP)和神經系統的可塑性變化〔8〕。Kato等〔9〕認為，NO 的局部釋放能調節海馬 CA1 區的LTP閾值，激活NMDA受體釋放NO，抑制LTP。

一氧化氮合酶(NOS)可以將精氨酸中的氮原子，在氧氣(O2)及其他輔助因素參與下合成NO。因此，多數實驗同過對NOS的研究來實現對NO作用的研究〔10〕。研究表明，NO參與了缺血性腦損傷的病理生理過程〔11〕。在此過程中，NO既有神經毒性又發揮了神經保護作用〔12〕。NO的神經保護作用表現在:①擴張血管，促進微循環，增加腦部血流量;②通過抑制血小板和白細胞的聚集，從而對血管內膜起到了保護;③抑制了由腎上腺素等物質產生的血管收縮，從而可以減輕缺血性腦損傷〔13〕。NO的神經毒性作用表現在:①大量羥自由基和二氧化氮自由基引起細胞蛋白質、核酸及脂肪膜損傷，導致細胞膜發生脂質過氧化作用，從而引起神經元死亡〔14〕;②神經毒性的產生是NO通過形成NO-鐵復合物、巰基蛋白的氧化，形成超氧陰離子等方式實現的〔13〕。③神經元的遲發性死亡是由NO產生的ONOO-使線粒體內的錳超氧化物歧化酶失活，從而導致線粒體內O2

-增多引發的。腦缺血早期，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和nNOS表達水平都有所升高，其中eNOS產生的大量NO對腦有神經保護作用，但擴張腦血管的時間非常短暫，2 h后eNOS表達水平下降，對腦不再有保護作用;雖然nNOS比eNOS產生的NO少，但此種NO對腦有神經毒性作用。隨著缺血時間的逐漸延長，NO主要來源于nNOS。本實驗提示NGF和Svate-3對多發性腦梗死具有很好的治療效果。

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2 李冬梅，王 戈.多發性腦梗塞動物模型的研究及分析〔J〕．內蒙古中醫藥，2014;29(3):57-8.

3 張 曄，張 艷，周酈楠.多發性腦梗死大鼠乳頭體一氧化氮合酶改變〔J〕．中國實用醫藥，2012;7(6):37-8.

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7 陳 琳，高 署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在腦缺血損傷中的作用〔J〕．安徽醫藥，2004;8(1):3-6.

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11 Nishimura M，Izumiya Y，Higuchi A，et al．Adiponectin prevents cerebral ischemic injury through endothelia nitric oxide synthase dependent mechanisms〔J〕．Circulation，2008;117(2):84-91.

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13 陳俊拋，鄭文權，田時雨，等.大鼠腦缺血時腦組織中NOS1陽性神經元變化的連續觀察〔J〕．臨床神經病學雜志，1998;11(6):323-5.

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