何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺磷酸化cyclinD1蛋白表達(dá)的影響

葛志華 崔宙開 楊 寧 李俊玫 王春艷 于海忠 楊佳寧

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，cyclinD1可以和CDK4/CDK6形成復(fù)合物并產(chǎn)生蛋白激酶活性，促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)變，加快細(xì)胞周期進(jìn)程。目前，關(guān)于cyclinD1過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞失控、癌變的研究很多，而對于cyclinD1與衰老的研究較少。孫潔等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)菟絲子醇提液可通過影響細(xì)胞調(diào)控因子p16、cyclinD1表達(dá)延緩肝細(xì)胞衰老。本文觀察何首烏飲對下頜下腺磷酸化cyclin D1的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 OLYMPUS顯微鏡(日本)，VT1000S振蕩切片機(jī)(德國Leica公司)，何首烏飲方劑由炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓六味中藥組成，藥物均購自承德富爾康藥業(yè)有限公司，磷酸化cyclinD1抗體(上海邁新生物科技有限公司)。

1.2 何首烏飲給藥方法 高、中、低劑量何首烏飲分別為，3.872、1.936 及 0.968 g·100 g－1· d－1，分別水煎濃 縮 成0.6 ml·100 g－1·d－1，灌胃，1 次/d。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選用8周齡清潔級(jí)SD雌性大鼠90只，體重180～220 g(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):605106)，隨機(jī)分為預(yù)防性和治療性兩大實(shí)驗(yàn)，預(yù)防性實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、何首烏飲預(yù)防高、中、低劑量組，治療性實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、自然恢復(fù)組、何首烏飲治療高、中、低劑量組，每組9只。

1.4 各組動(dòng)物的處理 預(yù)防性實(shí)驗(yàn)部分:正常組大鼠正常喂養(yǎng) 60 d。模型組腹腔注射 D-半乳糖 0.5 ml·100 g－1·d－1，1次/d，連續(xù)60 d。何首烏飲預(yù)防高、中、低劑量組大鼠腹腔注射D-半乳糖的同時(shí)分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，1次/d，連續(xù)60 d。治療性實(shí)驗(yàn)部分:陰性對照組稱重后按0.5 ml·100 mg－1·d－1腹腔注射生理鹽水，1 次/d，連續(xù) 60 d 后改為生理鹽水灌胃(0.6 ml·100 g－1·d－1)60 d;另外4組用 D-半乳糖腹腔注射，1次/d，連續(xù)60 d后，取其中3組作為何首烏飲治療高、中、低劑量組每天分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，連續(xù)60 d;另一組衰老模型作為自然恢復(fù)組正常喂養(yǎng)60 d。

1.5 取材、固定及切片的制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，開胸，經(jīng)左心室插管入主動(dòng)脈，生理鹽水沖凈血液后4%多聚甲醛灌注、固定取雙側(cè)下頜下腺，4%多聚甲醛后固定過夜。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚6μm，每隔30張取相鄰5張，裱于APES處理過的載玻片上，置于37℃溫箱干燥后進(jìn)行脫蠟、蘇木精-伊紅染色、去除組織蛋白等處理，操作完成后封片。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 磷酸化cyclinD1陽性顆粒呈黃色或棕黃色，對磷酸化cyclinD1免疫細(xì)胞化學(xué)染色的切片，在400倍顯微鏡下進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每只動(dòng)物取3張切片，每一切片隨機(jī)檢查3個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞中陽性細(xì)胞率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

磷酸化cyclinD1在正常及實(shí)驗(yàn)組大鼠下頜下腺的腺泡細(xì)胞、顆粒曲管及其他導(dǎo)管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，磷酸化cyclinD1陽性顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈黃色或棕黃色(圖1)。表1可見，預(yù)防性實(shí)驗(yàn)部分的組間磷酸化cyclinD1蛋白的表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，正常組最高，模型組最低，各預(yù)防組中以預(yù)防中劑量組效果最好(P＜0.01)。治療性實(shí)驗(yàn)部分的組間磷酸化cyclinD1蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，陰性對照組最高，自然恢復(fù)組最低，各治療組中以治療中劑量組最高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠下頜下腺磷酸化cyclinD1的表達(dá)(x±s，n=9)

圖1 各組大鼠下顎下腺磷酸化cyclin D1表達(dá)(SDAB，×400)

3 討論

機(jī)體衰老是不可避免的自然現(xiàn)象。衰老時(shí)，細(xì)胞的增殖能力減退，甚至完全停滯，使功能細(xì)胞難以更新，臟器萎縮、功能衰退。細(xì)胞周期停滯是細(xì)胞衰老的一個(gè)關(guān)鍵特征。細(xì)胞周期的進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDKI)等調(diào)控因子及之間的相互作用調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期蛋白在每次間期時(shí)被合成，而在有絲分裂時(shí)被降解，呈周期性的波動(dòng)。細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞衰老關(guān)系密切。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白有十多種，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 cyclin 分 A、B、C、D(D1、D2、D3)、E 、F、H，其中 cyclinD 是 G1期周期蛋白，在G1期或G1/S期交界處發(fā)揮作用，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK4/CDK6形成復(fù)合體催化 RB蛋白磷酸化，Rb蛋白磷酸化后失活，釋放E2F，游離的E2F啟動(dòng)G1/S期轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。如果抑制cyclinD在G1期表達(dá)，細(xì)胞將不能進(jìn)入S期〔2〕。cyclinD過度表達(dá)時(shí)則可縮短G1期間隔降低細(xì)胞對促細(xì)胞分裂劑的依賴性〔3〕。

衰老細(xì)胞中，一些與細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)多降低，如cdk2，G2-cyclin(cyclin A 及 B)以及 c-fos、AP-1的表達(dá)均降低。對G1-cyclin(cyclin C、D及E)的表達(dá)雖無影響，但有研究表明〔4〕，在衰老的人成纖維細(xì)胞中CDKI因子增多，cyclinDm-RNA水平比休眠細(xì)胞高很多倍，這必然導(dǎo)致過量的cyclinD產(chǎn)生，但多為無活性的cyclinD/CDK4復(fù)合物，而磷酸化cyclinD卻比休眠細(xì)胞少得多，而只有這種磷酸化的cyclinD才可以提高復(fù)合物的活性。有活性cyclinD/CDK4復(fù)合物少，使Rb蛋白不能磷酸化，則細(xì)胞不能通過“R”限制點(diǎn)而阻滯于G1期〔5〕。另有研究表明，衰老細(xì)胞中雖然CDK2總磷酸化水平不變，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平卻下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G1期〔4〕。本實(shí)驗(yàn)說明何首烏飲可能通過促進(jìn)cyclinD蛋白磷酸化阻斷cyclinD/CDK4-CDK6-/Rb/E2F途徑對Rb蛋白的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，延緩衰老，其中以預(yù)防中劑量組效果最好。

1 孫 潔，李 晶，歐 芹，等.菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝細(xì)胞p16和cyclinD1基因表達(dá)的影響〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2011;31(21):4208-10.

2 溫進(jìn)坤，韓 梅.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)(理論與研究技術(shù))〔M〕．北京:科學(xué)出版社，2010:357-73.

3 Shan NG，Trivedi TI，Tankshali RA，et al．Stat3 expression in oral squamous cell carcinoma:association with clinicopathological parameters and survival〔J〕．Int J Biol Markers，2006;21(1):175-83.

4 Dulic V，Drullinger LF，Lees E，et al．Altered regulation of G1 cyclins in senescent human diploid fibroblasts:accumulation of inactive cyclin ECdk2 and cyclin D1-Cdk2 complexes〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，1993;90(23):11034-8.

5 Stein GH，Dulic V.Origins of G1 arrest in senescent human fibroblasts〔J〕．Bioessay，1995;17(6):537-43.