辛伐他汀對高脂血癥大鼠胸主動脈壁白介素-2、RANTES和趨化因子受體1表達的影響

張哲瑩 張 楠 高建芝 王淑秀

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

高脂血癥是動脈粥樣硬化(AS)的主要危險因素之一。單核細胞黏附于血管壁并進入內(nèi)皮下形成泡沫細胞是AS發(fā)生的重要事件。單核細胞的遷移主要由趨化因子介導〔1〕。依賴正常T細胞激活表達和分泌的因子RANTES屬于CC型趨化因子，對白有趨化和激活作用，多種細胞類型均可分泌該因子，如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、活化的 T細胞、巨噬細胞和血小板〔2～4〕。趨化因子的作用均與其相應(yīng)受體的表達密切相關(guān)，其生物活性由靶細胞表面相應(yīng)的受體介導。CC型趨化因子的受體中，趨化因子受體1(CCR1)和 RANTES的親和力較高〔5〕。對于高脂血癥能否誘導AS病灶平滑肌細胞表達較高水平的RANTES及CCR1，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。白介素-2(IL-2)主要由T細胞產(chǎn)生。IL-2可以增強CC型趨化因子RANTES、MIP-1α及其受體CCR-1的表達，促進炎癥的發(fā)生〔6〕，但在高脂血癥形成AS過程中IL-2是否也起著重要作用還不清楚。本文我們觀察AS病灶中IL-2、RANTES和CCR-1的表達情況及辛伐他汀對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級健康雄性SD大鼠30只，體重(200±20)g，由河南省實驗動物中心提供(合格證號:SC3K豫2005-0001)。IL-2兔抗鼠多克隆抗體(工作濃度1∶200)、RANTES(工作濃度1∶100)兔抗鼠多克隆抗體、CCR-1(工作濃度1∶100)兔抗鼠多克隆抗體、即用型免疫組化試劑盒SA-1022、DAB顯色劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Trizol RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，RT-PCR試劑盒及PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗分組 30只SD大鼠隨機分為對照組、高脂飲食組和辛伐他汀組，每組10只。對照組用普通飼料喂養(yǎng);高脂飲食組用高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料成分:普通飼料65%，豬油12%，蔗糖5%，奶粉5%，雞蛋10%，麻油1%，食鹽2%)。辛伐他汀組在采用高脂飲食組飼料喂養(yǎng)4 w后，每天以5 mg/kg的辛伐他汀灌胃，并繼續(xù)給予高脂飲食組飼料。

1.3 HE染色 動物心臟取血后，迅速取其胸主動脈約1 cm立即投入新鮮配置的中性福爾馬林固定液中固定24 h。脫水，透明，浸蠟，包埋，并貼上相應(yīng)組的標簽。所有蠟塊連續(xù)切片(厚度4μm)，HE染色后觀察主動脈病理形態(tài)學變化。

1.4 免疫組織化學染色 按照試劑說明書進行染色。陰性對照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其余步驟相同。RANTES和CCR1蛋白表達陽性結(jié)果均為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)粗細不均的棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片在200倍光學顯微鏡下隨機選取3個視野測RANTES、CCR1的平均灰度值。

1.5 RT-PCR檢測 應(yīng)用TRIzol試劑提取血管平滑肌組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。RANTES引物序列:正鏈為 5’CATCCCTCACCGTCATC 3’，負鏈為5’GCTCATCTCCAAATAGTTG 3’，PCR 擴 增 產(chǎn) 物 長 度 為257 bp。CCR1引物序列:正鏈為5’GGGAGTTCACTCACCATACCTGTAG 3’，負鏈為 5’GGTCCAGAGGAGGAAGAATAGAAG 3’，PCR擴增產(chǎn)物長度為223 bp。IL-2引物序列:正鏈為5＇TTGCACTGACGCTTGTCCTCCTTGTCAACA 3＇，負鏈為 5＇CCATCTCCTCAGAAATTCCACCACAGTTGC 3＇，PCR擴增產(chǎn)物長度為398 bp。內(nèi)參β-actin引物序列:正鏈為 5’CTTTTGTGCCTTGATAGTTC3’，負鏈為 5’GAGTCCTTCTGACCCATAC 3’，PCR 擴增產(chǎn)物長度為265 bp。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下攝片，用Syngene公司圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，以各組目的基因與β-actin基因擴增條帶積分吸光度值的比值作為各指標mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及兩兩比較SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血脂濃度 高脂飲食組大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量明顯高于對照組和辛伐他汀組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清TC和TG比較(n=10，x±s，mmol/L)

2.2 HE染色顯示 對照組胸主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞排列整齊。高脂飲食組局部可見大鼠主動脈內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮細胞壞死脫落，中膜平滑肌細胞排列紊亂，內(nèi)膜下可見泡沫細胞(圖1)。辛伐他汀組介于對照組和高脂飲食組之間。

圖1 SD大鼠胸主動脈病理組織學觀察(HE，×400)

2.3 大鼠主動脈壁細胞RANTES蛋白表達 RANTES蛋白的陽性表達呈粗細不均勻的棕黃色顆粒，局限于細胞質(zhì)。RANTES蛋白在高脂飲食組表達較強，顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表2，圖2)。

表2 各組大鼠胸主動脈壁RANTES、CCR-1和IL-2蛋白表達(平均灰度值，x±s，n=10)

圖2 SD大鼠胸主動脈壁RANTES蛋白的表達(SABC，×400)

2.4 大鼠主動脈壁細胞CCR1蛋白表達 CCR1蛋白的陽性表達呈粗細不均的棕黃色顆粒，局限于細胞質(zhì)。CCR1蛋白在高脂飲食組的表達顯著高于正常對照組(P＜0.01)和辛伐他汀治療組(P＜0.05)(表2，圖3)。

2.5 大鼠主動脈壁細胞IL-2蛋白表達 IL-2蛋白陽性染色為細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。IL-2蛋白在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表2，圖4)。

圖3 SD大鼠胸主動脈壁CCR-1蛋白的表達(SABC，×400)

圖4 SD大鼠胸主動脈壁IL-2蛋白的表達(SABC，×400)

2.6 大鼠動脈壁中RANTES mRNA表達 RANTESmRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表3，圖5)。

表3 各組大鼠主動脈壁中RANTES、CCR-1和IL-2 mRNA的表達(吸光度值，x±s，n=10)

圖5 各組大鼠動脈壁IL-2 mRNA表達

2.7 大鼠動脈壁細胞CCR1 mRNA表達 CCR1 mRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀各組組(P＜0.05)(表3，圖6)。

圖6 各組大鼠主動脈壁RANTES表達

2.8 大鼠動脈壁細胞IL-2 mRNA表達 IL-2 mRNA在高脂飲食組的表達顯著高于對照組(P＜0.01)和辛伐他汀組(P＜0.05)(表3，圖7)。

圖7 CCR1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

關(guān)于AS發(fā)病機制，眾多發(fā)病假說先后被提出，但其確切病因和發(fā)病機制迄今尚未完全闡明〔7〕。AS的形成主要是脂質(zhì)沉積于內(nèi)膜下引起的一系列病變。因此高脂血癥作為AS形成過程中一個重要的、獨立的危險因素，越來越受到人們的重視。單核細胞進入內(nèi)皮下形成泡沫細胞是AS發(fā)生的重要事件。因而研究單核細胞遷入內(nèi)皮下間隙的機制對于闡明AS的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。而在吸引白細胞遷移的過程中主要是趨化因子在起作用。

RANTES屬于CC型趨化因子，由正常T細胞表達和分泌，是一種可溶的分子量為8 kD的小分子蛋白質(zhì)〔8〕，具有多種不同的生物學功能，對多種白細胞有趨化和激活作用。Veillard等〔9〕報道在復制C57BL/6J(LDLR-/-)小鼠高膽固醇血癥模型基礎(chǔ)上通過免疫組化染色檢測到病灶局部巨噬細胞源性泡沫細胞、T淋巴細胞高表達RANTES。這些都表明RANTES在AS形成中可能起著非常重要的作用。而對于高脂血癥大鼠病灶局部是否表達RANTES增多尚未見報道。本實驗提示高脂血癥可以引起大鼠動脈病灶局部表達趨化因子RANTES增多。趨化因子的作用都是與其相應(yīng)受體的表達密切相關(guān)的。Schecter等〔10〕發(fā)現(xiàn)AS病變處的平滑肌細胞表達CC型趨化因子受體。國內(nèi)也有研究表明同型半胱氨酸(Hcy)可誘導培養(yǎng)的單核細胞和大鼠動脈平滑肌細胞CCR1的表達〔11，12〕。本實驗說明高脂血癥不僅可以引起大鼠動脈壁細胞表達趨化因子RANTES增多，也可以增強其受體CCR1的表達。所以，大鼠動脈壁細胞表達RANTES及CCR1增強，可能是高脂血癥引起AS形成的機制之一。IL-2是一種具有廣泛生物活性的細胞因子，其主要生物學功能是活化T細胞，促進細胞因子產(chǎn)生;刺激NK細胞增殖，增強NK殺傷活性;促進B細胞增殖和分泌抗體;激活巨噬細胞〔13～15〕。有研究報道IL-2在小鼠陰道白假絲酵母菌病感染模型中增加RANTES的表達，且有報道IL-2可以增強培養(yǎng)的T細胞上 CCR-1的表達，且呈劑量依賴性〔16，17〕。但在高脂血癥形成AS過程中IL-2是否也起著重要作用還不清楚。本文通過檢測高脂血癥SD大鼠主動脈壁細胞IL-2表達情況來觀察IL-2在AS形成中的作用。實驗結(jié)果顯示IL-2在動脈壁細胞表達增強，其可能通過進一步誘導RANTES和CCR1表達增多而促使AS形成的，從實驗結(jié)果看IL-2可能也是高脂血癥引起AS形成的原因之一。

辛伐他汀是治療AS的傳統(tǒng)藥物，可以抑制內(nèi)源性膽固醇的合成〔18〕，具有降低血脂的作用，最近又發(fā)現(xiàn)辛伐他汀除了調(diào)脂作用外還有抗炎、抗氧化、抑制平滑肌增殖的作用〔19～22〕。現(xiàn)已普遍證實辛伐他汀對高脂血脂引起的AS治療效果是比較好的。本研究表明高脂血癥可能通過誘導大鼠胸主動脈血管壁細胞中IL-2、RANTES和CCR-1的表達引起AS的發(fā)生，辛伐他汀可以很好地抑制這一過程，為臨床患者通過降低IL-2、RANTES和CCR-1的表達來預防AS的發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。

1 Sheikine Y，Hansson GK.Chemokines and atherosclerosis〔J〕．Ann Med，2004;36(2):98-118.

2 Appay V.RANTES:a versatile and controversial chemokine〔J〕．Trend Immunol，2001;22(2):83-7.

3 Inngjerdingen M，Damaj B，Maghazachi AA，et al．Expression and regulation of chemokine receptors in human natural killer cells〔J〕．Blood，2001;97(2):367-75.

4 Ali S，Kaur J，Patel KD.Intercellular cell adhesion molecule-1，vascular cell adhesion molecule-1，and regulated on activation normal T cell expressed and secreted are expressed by human breast carcinoma cells and support eosinophil adhesion and activation〔J〕．Am J Pathol，2000;157(1):313-21.

5 Ward SG，Westwick J.Chemokines:understanding their role in T-lymphocyte biology〔J〕．Biochem J，1998;333(Pt 3):457-70.

6 Loetscher P，Seitz M，Baggiolini M，et al．Interleukin-2 regulates CC chemokine receptor expression and chemotactic responsiveness in T lymphocytes〔J〕．J Exp Med，1996;184(2):569-77.

7 Kulbertus H，Lancellotti P.Atherosclerosis:a complex disease〔J〕．Rev Med Liege，2012;67(5-6):273-8.

8 李 臻，張遠強.β-趨化性細胞因子RANTES的研究進展〔J〕．生理科學進展，2006;37(1):79-82.

9 Veillard NR，Steffen S，Burger F，et al．Differential expression patterns of proinflammatory and antiinflammatory mediators during atherogenesis in mice〔J〕．Arterioscler Thromb Biol，2004;24(12):2339-44.

10 Schecter AD，Calderon TM，Berman AB，et al．Human vascular smooth muscle cellspossess functional CCR5〔J〕．JBiol Chem，2000;275(8):5466-71.

11 刑 偉，鄧仲端，倪 娟.同型半胱氨酸對人單核細胞株THP21表達趨化因子受體CCR1 mRNA的影響〔J〕．華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2003;32(3):235-8.

12 張哲瑩，楊瑞，王淑秀.同型半胱氨酸誘導大鼠主動脈平滑肌細胞依賴正常T細胞激活和分泌的因子、趨化因子受體1的表達和機制探討〔J〕．新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2011;28(6):703-7.

13 Boyman O，Sprent J.The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system〔J〕．Nat Rev Immunol，2012;12(3):180-90.

14 Albright JW，Bream JH，Bere EW，et al．Aging of innate immunity:functional comparisons of NK/LAK cells obtained from bulk cultures of young and aged mouse spleen cells in high concentrations of interleukin-2〔J〕．Exp Gerontol，2004;39(1):73-82.

15 Elmslie RE，Dow SW，Ogilvie GK.Interleukins:biological properties and therapeutic potential〔J〕．J Vet Intern Med，1991;5(5):283-93.

16 徐 艷.RANTES與IL-2在小鼠陰道白假絲酵母菌病模型中作用探討〔D〕．中南大學，2007:1-20.

17 Loetscher P，Seitz M，Baggiolini M，et al．Interleukin-2 regulates CC chemokine receptor expression and chemotactic responsiveness in Tlymphocytes〔J〕．JExp Med，1996;184(2):569-77.

18 Fox KM，Gandhi SK，Ohsfeld RL，et al．Comparison of low-density lipoprotein cholesterol reduction after switching patients on other statins to rosuvastatin or simvastatin in a real-world clinical practice setting〔J〕．Am JManag Care，2007;13(Suppl 10):S270-5.

19 Wilson SH，Best PJ，Edwards WD，et al．Nuclear factor-kappaB immunoreactivity is present in human coronary plaque and enhanced in patients with unstable angina pectoris〔J〕．Atherosclerosis，2002;160(1):147-53.

20 Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences〔J〕．J Immunol，2006;177(11):7485-96.

21 Shakhov AN，Collart MA，Uassalli P，et al．κB-type enhancers are involved in lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the tumor necrosis factor a gene in primary macrophages〔J〕．J Exp Med，1990;171(1):35-47.

22 Thanos D，Maniatis T.NF-κB:a lesson in family values〔J〕．Cell，1995;80(4):529-32.