表觀遺傳修飾炎癥相關基因在高血糖“代謝記憶”中的作用及機制

徐 瑾 廖云飛 衷誠群 楊 娟

(宜昌市第二人民醫院 三峽大學第二人民醫院，湖北 宜昌 443000)

早期高血糖導致的血管損傷在血糖控制至正常水平后仍持續存在，并成為后期血管病變發生發展的重要致病因素之一;而在早期控制高血糖至理想水平，則可以延緩甚至阻斷血管并發癥的形成;這一現象被稱之為高血糖“代謝記憶”〔1〕。已有研究證明，高血糖的“代謝記憶”可被靶細胞的表觀遺傳改變〔2〕。本文分析表觀遺傳修飾炎癥相關基因在高血糖“代謝記憶”中的作用及相關機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠 購自南京君科生物工程有限公司，均為雄性，6周齡，體重150～170 g，60只大鼠隨機分為正常對照組、高糖組、代謝記憶組各20只。其中高糖組采用鏈脲佐菌素(STZ)溶液腹腔內注射，高糖狀態持續24 w;代謝記憶組采用STZ溶液腹腔內注射，誘導成模后高糖狀態持續12 w后，隨后使用胰島素控制血糖至正常范圍，胰島素正常狀態持續12 w。

1.2 實驗試劑和儀器 主要實驗試劑:細胞、組織總RNA提取試劑盒、STZ、Luciginin、apocynin、L-NAME、DPI購自美國 Sigma公司、PrimeScript逆轉錄試劑盒和SsoAdvanced實時定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司、超氧化物陰離子熒光條件(DHE)和活性氧簇細胞滲透性指示劑(CM-H2DCFDA)購自美國 Life technologies公司、內源性一氧化氮合酶(eNOS)抗體和PhosphoeNOS(Serl177)抗體購自美國CST公司。

主要實驗儀器:CFX96實時PGR儀和ChemiDoc XRS+化學發光成像系統購自美國Bio-Rad公司、F-4500熒光分光光度計購自美國Themo公司、Olympus 1X71倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司、Amexa Nucleofector核酸電轉染儀購自德國Amexa公司。

1.3 實驗方法 造模喂養24 w后，麻醉處死大鼠，解剖分離大鼠主動脈組織，清除主動脈組織周圍結締組織及血污，將游離主動脈送往氧化應激及NO生物活性檢測，操作如下:取15 mg主動脈組織置入250μl裂解液中，將其研磨粉碎，將15μl蛋白酶K及550μl RNase-free ddH2O滴入研磨后漿液中，56℃溫箱內靜置15 min，1 500 r/min離心，取上清。將0.5倍體積無水乙醇滴入上清液中，混合均勻，將溶液轉入CR3吸附柱中，1 500 r/min離心，棄廢液，收回吸附柱;將300μl去蛋白液RW1加入置CR3吸附柱內，1 500 r/min離心，棄廢液，收回吸附柱;再依次將75μl DNaseI工作液、350μl去蛋白液RW1及450μl漂洗液RW加入到CR3吸附柱內，同上離心、棄廢液，收回吸附柱操作，最終將吸附柱置于新離心管內，加入60μl RNase-free ddH2O，靜置5 min，1 500 r/min離心，最終得到RNA溶液。取2μl RNA溶液置于分光光度計內檢測，記錄單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1、IL-6 mRNA表達水平、eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平。NO活性水平、活性氧(ROS)水平檢測選用熒光探針檢測，操作嚴格按儀器說明書進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 3組主動脈血管內皮功能對比 正常對照組NO含量顯著高于高糖組和代謝記憶組，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表達則顯著低于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組NO含量顯著高于高糖組，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表達則顯著低于高糖組(P＜0.01)。見表1。

2.2 3組主動脈血管組織ROS水平對比 正常對照組DHE和CM-H2DCFDA熒光強度顯著低于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組的DHE和CM-H2DCFDA熒光強度顯著低于高糖組(P＜0.01)。見表1。

表1 3組主動脈血管內皮功能、血管組織ROS水平對比(x±s，n=20)

2.3 3組主動脈血管組織eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比較 正常對照組eNOSmRNA和蛋白表達水平顯著低于高糖組和代謝記憶組，而Ser-1177磷酸化水平顯著高于高糖組和代謝記憶組(P＜0.01);代謝記憶組的eNOSmRNA和蛋白表達水平顯著低于高糖組，而Ser-1177磷酸化水平顯著高于高糖組(P＜0.01)。見表2。

表2 3組主動脈血管組織eNOS基因表達和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比較(x±s，n=20，%正常對照組)

3 討論

表觀遺傳特指基因于核苷酸序列不變的情況下出現表達活性的可遺傳性改變，其具有無DNA序列變化、可遺傳，并且可能引發基因活性及功能變化的特征。表觀遺傳變化誘因可能表現為環境、飲食以及藥物影響等〔3〕。表觀遺傳可以對基因表達激活或者抑制進行修飾及調節，早期大鼠的高血糖可誘導血管eNOS基因出現表觀遺傳，大鼠eNOS表達活性出現改變。而血管eNOS則可生成一種有效的血管張力調節物質——NO，該物質是目前已知的唯一血管舒張因子，其可介導血管舒張，還具有抑制平滑肌細胞增生、抗白細胞黏附及血小板聚集等功效〔4〕。血管內皮細胞損傷是糖尿病患者血管相關并發癥的根本發病機制，血管內皮障礙也被臨床確定為糖尿病相關并發癥的早期征兆。糖尿病相關血管并發癥患者及動脈粥樣硬化患者其eNOS的NO合成水平均顯著低于正常人群，因此，NO水平也成為臨床衡量患者內皮功能損傷程度的重要標志物〔5〕。本研究也證實了上述結論。eNOS的活性可通過多個磷酸化反映位點調節，Ser-1177正是其中重要的一個位點〔6〕。高糖可導致Ser-1177磷酸化水平下降，進而導致NO合成水平下降，并阻斷細胞己糖胺途徑，進一步抑制eNOS活性。本研究表明高糖組和代謝記憶組內皮功能損傷更為嚴重。

MCP-1是趨化因子的一種，其可于動脈粥樣硬化早期將單核細胞趨化至血管壁內;ICAM-1是具有較強的促單核細胞黏附血管內皮細胞作用的炎癥因子〔7〕;IL-6是淋巴因子的一種，其具有增強細胞氧化應激壓力，提高細胞通透性的功效，此外，IL-6還可抑制NO的血管擴張反應，導致患者內皮功能失調嚴重化〔8〕。本研究提示高糖組和代謝記憶組大鼠均存在較為明顯的內皮功能異常癥狀，但控制血糖后內皮功能可有明顯改善。早期的高血糖給內皮細胞造成了持久性的損傷“記憶”。

ROS是氧化應激重要參與物質之一，而氧化應激已被臨床確定為糖尿病并發癥重要形成機制，ROS可通過多途徑參與糖尿病并發癥的發生、發展，如激活蛋白激酶C，誘導晚期糖基化終末產物生產，激活氨基己糖通路等〔9〕。DHE和 CMH2DCFDA熒光強度是反映ROS表達水平的重要檢測手段，其強度與ROS表達水平呈正相關〔10〕。

綜上，早期高血糖對血管內皮細胞功能存在極大損傷，即使血糖水平恢復正常，其eNOS表達依然較高，即出現高血糖代謝記憶。

1 高 泓，謝春光，郭寶根，等．從伏邪理論對糖尿病大血管病變代謝記憶的理論探討〔J〕．時珍國醫國藥，2013;24(9):2203-4．

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3 Sladden MJ，Sladden CS.Maximizing the quality of review articles〔J〕．Brit JDermatol，2007;157(2):409.

4 Hiramatsu M，Oguri M，Kato K.Association of a polymorphism of BTN2A1 with type2 diabetes mellitus in Japanese individuals〔J〕．Diabetic Med，2011;28(11):1381-7.

5 Pirola L，Balcerczyk A，Okabe J，et al.Epigenetic phenomena linked to diabetic complications〔J〕．Nature Rev Endocrinol，2010;6(12):665-75.

6 劉 群，侯以琳，孫妍蕾．波動性高血糖、代謝記憶與糖尿病慢性并發癥〔J〕．臨床內科雜志，2014;31(10):714-5．

7 Cho YM，Kim TH，Lim S.Type2 diabetes-associated genetic variants discovered in the recent genome-wide association studies are related to gestational diabetes mellitus in the Korean population〔J〕．Diabetologia，2009;52(2):253-61.

8 謝滿云，唐仕波．表觀遺傳調控在糖尿病視網膜病變中的研究進展〔J〕．中華眼底病雜志，2014;30(2):212-6．

9 王燕飛，侯 粲，蘇 欣，等．組蛋白乙酰化與糖尿病〔J〕．中華內分泌代謝雜志，2014;30(2):167-70．

10 黃 焱，陳 婷，杜 濤，等．糖尿病大鼠晶狀體高糖代謝記憶機制的研究〔J〕．中國實用眼科雜志，2014;32(3):375-8．