Fas途徑調控芬太尼與5-氟尿嘧啶聯合誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡

王志學 張曉俠 雷 燕 李 艷 蘇天亮

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北 承德 067000)

近年來，腫瘤綜合治療的實施使乳腺癌的死亡率逐年下降，癌痛治療愈顯重要。前期研究證實〔1～3〕，一定濃度的嗎啡、5-氟尿嘧啶(5-FU)及聯合應用48 h對人乳頭癌細胞株MCF-7有促進凋亡作用，并顯著上調Fas表達和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8活性，兩藥聯合應用啟動外源性凋亡途徑具有協同作用，并且與其中嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關系。報道顯示〔4～6〕，芬太尼對MCF-7人乳腺癌細胞劑量依賴性地抑制增殖、促進凋亡，顯著減少腫瘤細胞所致的組織破壞。本文旨在探討芬太尼與5-FU聯合應用對乳腺癌細胞的凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin VEGFP)，南京凱基生物科技發展有限公司;碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司;RPMI1640培養基，GIBCOBRL公司;胎牛血清，天津血液學研究所;胰蛋白酶，中國醫學科學院血研所科技公司;鼠抗人Fas及Caspase-8、Western印跡單克隆抗體，福州邁新生物技術有限公司;β-actin一抗、山羊抗鼠Western印跡二抗，美國Santa Cruz公司。YT-CJ-1N超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發中心;FACSCalibur流式細胞儀，美國B＆D公司;CO2電熱恒溫培養箱，日本SANYO公司;LD5-IA低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;熒光倒置顯微鏡，日本尼康;光學顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.1.2 實驗藥物 芬太尼注射液，宜昌人福藥業;5-FU注射液，上海旭東海普藥業。MCF-7，南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞復蘇成功后，調整濃度為1×106/ml接種于培養瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養箱內，用RPMI1640完全培養液進行培養，隔日換液。觀察待貼壁70% ～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組 共分為8組，分別用含不同藥物的RPMI1640完全培養液培養。U組(未處理組)即對照組，LF組為0.1μmol/L，MF組為1μmol/L，HF組為10μmol/L芬太尼處理組，FU組為 500μmol/L 5-FU處理組，LF+FU組為0.1μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯合處理組，MF+FU組為1μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯合處理組，HF+FU組為10μmol/L芬太尼與500μmol/L 5-FU聯合處理組。

1.2.3 流式細胞術(FCM)檢測Annexin V-EGFP/PI染色的細胞凋亡情況 取對數生長期的細胞，調整細胞濃度約5×105/ml接種于25 ml細胞培養瓶，其貼壁后更換為含不同藥物的培養液(詳見1.2.2)5 ml，每組5瓶，孵育48 h。屆時吸棄上清，消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細胞(約106/ml以上)于離心管;4℃低速離心緩沖液1 500 r/min、5 min后棄上清，重懸于500μl的 Binding Bufferr溶液，加入 5μl Annexin V-EGFP及5μl PI，混勻，室溫避光反應15 min;1 h內流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 Western印跡檢測Fas、Caspase-8表達 另取對數生長期細胞，以5×105/ml接種于25 ml培養瓶內，其貼壁后更換含不同藥物的培養液(詳見1.2.2)，每組5瓶，孵育48 h。充分裂解，4℃高速離心，取上清－80℃保存。二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白質濃度測定;煮沸變性、冰浴;蛋白電泳，轉膜，封閉。分別加入Fas及Caspase-8一抗、β-actin一抗，4℃孵育過夜。洗膜，加入二抗，室溫2 h。曝光、定影、掃描，軟件分析目的條帶的灰度值及相應β-actin條帶的灰度值，以兩者比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.5軟件進行處理，所有數據資料以x±s表示，進行單因素方差分析與析因設計方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗;實驗組Fas、Caspase-8變化作Pearson相關分析。

2 結果

2.1 各組凋亡率變化情況 與U組相比，單獨應用芬太尼處理時1μmol/L及10μmol/L組均引起凋亡率增加(P＜0.05，P＜0.01)，單獨應用500μmol/L 5-FU后凋亡率亦明顯增加(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯合應用，各組較單獨應用5-FU或該濃度芬太尼單獨應用相比，凋亡率均明顯增加，且均具有協同作用(P＜0.01)。且凋亡率隨其中芬太尼濃度增加依次增加。見表1。

表1 處理48 h各組細胞凋亡率及Fas、Caspase-8蛋白表達情況(x±s，n=5)

2.2 Fas、Caspase-8表達情況 與U組相比，單獨應用芬太尼處理1μmol/L及10μmol/L組均引起Fas、Caspase-8表達增強(P＜0.05，P＜0.01)，500 μmol/L 5-FU 單獨應用后 Fas、Caspase-8表達增強(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯合應用，各組較單獨應用5-FU或該濃度芬太尼單獨應用相比，Fas、Caspase-8表達均明顯增強，且均具有協同作用(P＜0.01)。實驗組Caspase-8活性變化與實驗組Fas抗原表達變化作Pearson相關分析表明兩者之間呈顯著正相關(r=0.877，P＜0.01)。見表1。

3 討論

阿片類藥物通過多種機制影響腫瘤細胞生長，芬太尼抑制腫瘤生長的機制之一即是誘導凋亡〔4～6〕。化療中的常用藥物5-FU可通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡亦早已證實。

對人類來說，誘導凋亡主要有外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑又稱死亡受體途徑，是通過細胞膜上的死亡受體，最典型的是Fas糖蛋白和腫瘤壞死因子(TNF)受體I激活，一旦細胞受到某些凋亡信號刺激，Fas被Fas-L占據后會導致受體聚合，向Fas表達的細胞內傳遞死亡信號，通過其死亡相關域蛋白(FADD)DED結構域募集并激活Caspase-8，形成死亡誘導信號復合體(DISC)，進而觸發Caspase酶系級聯反應導致細胞凋亡〔7，8〕。阿片樣物質可促進Fas誘導的細胞死亡早在1999 年就被 Yin 等〔9〕提出，Tegeder等〔10〕又檢測出嗎啡對MCF-7和MDA-MB231乳腺癌細胞處理后均引起Fas表達增加。而后，Yin等〔11〕又證實了嗎啡誘導的多種腫瘤細胞株凋亡或壞死，其機制之一可能就是激活Fas/FasL基因家族等一系列信號通路，通過促凋亡的FADD/P53通路和抗凋亡P13K/Art/核轉錄因子(NF-κB)通路綜合作用調控細胞凋亡。本研究發現，單獨應用1μmol/L、10μmol/L芬太尼處理時，通過顯著上調Fas表達、Caspase-8激活，啟動外源性凋亡途徑來誘導凋亡。5-FU可能通過激活Caspase、上調Fas受體的表達誘導腫瘤細胞凋亡的治療機制亦早已證實〔12，13〕，本研究結果中單獨應用500μmol/L 5-FU后顯著上調Fas表達、Caspase-8激活也正與此吻合。說明兩藥聯合應用可能在通過死亡受體途徑發揮協同作用促進細胞凋亡。這無疑為與化療同時實施的阿片類藥物癌痛治療增加了信心，另外其研究結果也可為乳腺癌患者手術麻醉及術后鎮痛制定合理方案提供一定的理論依據。

1 王志學，孫立新，宋有鑫，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯合應用對MCF-7乳腺癌細胞增殖凋亡的影響〔J〕．廣東醫學，2012;33(19):2881-4.

2 王志學，孫立新，李汝泓，等.不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯合應用MCF-7乳腺癌細胞凋亡與細胞周期的影響〔J〕．中國老年學雜志，2012;32(15):3223-6.

3 王志學，劉新偉，李汝泓，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯合應用通過Fas途徑誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡的體外研究〔J〕．實用醫學雜志，2013;29(8):1212-4.

4 張咸偉，丁漢琳，張傳漢，等.芬太尼MCF-7細胞增殖和細胞周期影響研究〔J〕．中國醫師雜志，2005;7(1):23-5.

5 丁漢琳，張咸偉，張傳漢.芬太尼影響MCF-7細胞凋亡的實驗研究〔J〕．實用醫學雜志，2004;20(12):1351-3.

6 El Mouedden M，Meert TF.The impact of the opioids fentanyl and morphine on nociception and bone destruction in a murine model of bone cancer pain〔J〕．Pharmacol Biochem Behav，2007;87(1):30-40.

7 Gu Q，Wang JD，Xia HH，et al.Activation of the caspase-8/Bid and Bax pathways in aspirin-induced apoptosis in gastric cancer〔J〕．Carcinogenesis，2005;26(3):541-6.

8 Hacker G，Weber A.BH3-only proteins trigger cytochrome c release，but how〔J〕?Arch Biochem Biophys，2007;462(2):150-5.

9 Yin D，Mufson RA，Wang R，et al.Fas-mediated cell death promoted by opioids〔J〕．Natrure，1999;397(6716):218.

10 Tegeder I，Grosch S，Schmidtko A，et al.G protein-independence G1cell cycle block and apoptosis with morphine in adenocarcinoma cell:in-volvement of p53 phosphorylation〔J〕．Cancer Res，2003;63(8):1846-52.

11 Yin D，Woodruff M，Zhang Y，et al.Morphine promotes Jurkat cell apoptosis through pro-apoptotic FADD/P53 and anti-apoptotic P13K/Art/NF-kappaB pathway〔J〕．JNeuroimmunol，2006;174(1-2):101-7.

12 Johnstone R，Ruefli A，Lowe S，et al.Apoptosis:a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕．Cell，2002;108(2):153-64.

13 Eichhorst ST，Muerkoster S，Weigand MA，et al.The chemotherapeutic drug 5-fluorouracil induces apoptosis in mouse thymocytes in vivo via activation of the CD95(APO-1/Fas)system〔J〕．Cancer Res，2001;61(1):243-8.