水飛薊賓體外抑制MCF—7細胞的增殖和TGF—β誘導的侵襲轉移

林峰 佟鑫 陳志杭

[摘要] 目的 探討水飛薊賓對人乳腺癌細胞MCF-7生長及侵襲轉移的抑制作用。 方法 將人乳腺癌細胞MCF-7用不同濃度的水飛薊賓處理后，采用MTT法檢測水飛薊賓對MCF-7細胞增殖的抑制作用；用transwell技術檢測MCF-7細胞在TGF-β培養體系中水飛薊賓對細胞侵襲力的影響； Western blot檢測腫瘤侵襲力相關蛋白MMP9和vimentin的表達。 結果 培養48 h后，50 μmol/L水飛薊賓組對MCF-7細胞的抑制率為（7.5±1.2）%，100 μmol/L水飛薊賓組對MCF-7細胞的抑制率為（24.6±2.8）%，150 μmol/L水飛薊賓組對MCF-7細胞的抑制率為（47.5±4.8）%， 200 μmol/L水飛薊賓組對MCF-7細胞的抑制率為（65.5±5.2）%；對照組穿過transwell膜的MCF-7細胞數為（119.4±25.7）個，TGF-β組穿過transwell膜的MCF-7細胞數為（401.6±48.5）個，100 μmol/L水飛薊賓+TGF-β組穿過transwell膜的MCF-7細胞數為（264.4±31.3）個；Western blot實驗表明水飛薊賓可降低MMP9和vimentin的表達。 結論 水飛薊賓抑制人乳腺癌細胞的生長和侵襲轉移。

[關鍵詞] 水飛薊賓；MCF-7；TGF-β；腫瘤侵襲轉移

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）17-0001-03

乳腺癌的發生率和死亡率僅次于肺癌，而在女性群體中是發生率最高的惡性腫瘤，它的高轉移性使之目前仍無法治愈[1]，對于中晚期不能進行手術治療的患者，藥物治療是首選的治療方法，因此發展新的乳腺癌的治療藥物具有十分重要的意義。水飛薊賓（Silibinin），是水飛薊素（Silymarin）中最主要的生物活性成分，主要從植物奶薊（Silybum marianum）中提取，臨床上主要用于保肝護肝[2]。近些年來，水飛薊賓還被發現具有抗腫瘤活性，對于多種腫瘤如結腸癌、乳腺癌等均具有良好抑制作用[3，4]，然而其對人乳腺癌細胞生長和侵襲轉移的抑制作用卻很少報道。因此，作者通過研究水飛薊賓對人乳腺癌細胞系MCF-7的生物效應，發現水飛薊賓可以抑制乳腺腫瘤細胞的生長和侵襲轉移。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RPIM-1640培養基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；transwell小室購于美國康寧公司；水飛薊賓、二甲亞砜、噻唑藍（MTT）購于美國Sigma公司；β-actin、MMP9、vimentin抗體購自美國Cell signal公司；ECL試劑盒購于美國pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 本實驗從2013年5月開始至2014年12月為止。人乳腺癌細胞MCF-7細胞系購于ATCC（American Type Culture Collection，美國模式培養物研究所），培養在RPMI-1640培養基中，含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 mg/mL鏈霉素，培養環境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2.2 細胞增殖抑制試驗 將MCF-7細胞按2×103/孔接種于96孔板，加入200 μL含10% FBS的RPIM-1640培養，設置3個復孔，并分別加入0、50、100、150、200 μmol/L的水飛薊賓培養24、48、72 h，加5 mg/mL MTT 20 μL，繼續培養4 h。棄上清，往孔中加150 μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570 nm波長下用酶標儀檢測OD值，腫瘤細胞生長抑制率=（OD對照組-ODsilibinin）/OD對照組×100%。

1.2.3 腫瘤細胞侵襲試驗 在transwell小室中接種1×104個MCF-7細胞置于24孔板中，上室培養基為無血清RPMI-1640培養基并加入2 ng/mL TGF-β及100 μmol/L水飛薊賓，下室培養基為含10%胎牛血清的RPMI-1640。培養24 h后取出transwell小室，用生理鹽水洗去小室內的細胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15 min后用0.1%結晶紫染色20 min，低倍鏡（100×）觀察4個隨機選擇的區域，計算細胞總數。

1.2.4 Western blot試驗 收集細胞，將細胞裂解后將蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉膜到PVDF膜（Millipore，USA）上。將膜在兔抗人MMP9或兔抗人vimentin一抗稀釋液中孵育過夜，之后再帶HRP酶活性的羊抗兔IgG二抗稀釋液中孵育2 h，ECL試劑顯色曝光。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 5軟件進行作圖，用SPSS10.0統計學分析軟件進行處理，所有實驗重復三次，實驗數據用均數±標準差（x±s）表示，P值計算采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水飛薊賓對人乳腺癌細胞系MCF-7的體外抑制作用

水飛薊賓對MCF-7細胞有良好的體外抑制作用，實驗數據表明隨著水飛薊賓濃度的增加，作用的時間的延長，水飛薊賓的體外抗乳腺癌效果越明顯，說明水飛薊賓對乳腺癌細胞的殺傷呈劑量和時間依賴性，結果見表1、圖1。

2.2 水飛薊賓抑制TGF-β誘導的腫瘤侵襲轉移

在TGF-β培養體系中加入水飛薊賓培養24 h后，穿過transwell膜的MCF-7細胞數目顯著下降（P<0.05），表明水飛薊賓有體外抑制乳腺癌細胞侵襲轉移的作用。見表2。

2.3 水飛薊賓下調MCF-7細胞MMP9和vimentin的表達

在TGF-β培養體系中加入水飛薊賓培養24 h后，MCF-7細胞的MMP9和vimentin的表達相比于未加水飛薊賓組顯著下降，提示水飛薊賓抑制乳腺癌細胞侵襲轉移的機制可能是下調腫瘤細胞MMP9和vimentin的表達水平。見圖2。

3 討論

水飛薊賓有十分廣泛和強烈的藥理活性，如水飛薊賓能抑制腫瘤細胞DNA的合成，抑制腫瘤細胞的增殖并阻滯細胞周期，誘導腫瘤細胞發生凋亡等，對包括乳腺癌在內的多種腫瘤均有十分良好的治療作用[5]。然而，水飛薊賓抗腫瘤的具體機制至今仍不十分清楚，需要更多的實驗研究。在本研究中，為了證實水飛薊賓有體外抗乳腺癌作用，作者用從低劑量到高劑量的水飛薊賓處理乳腺癌細胞系MCF-7，發現水飛薊賓確實有顯著的體外抗乳腺癌的藥理活性，且處理時間越長、濃度越高，其對MCF-7細胞增殖的抑制作用越明顯，表明水飛薊賓對腫瘤細胞的殺傷作用呈劑量和時間依賴性。

乳腺癌致死率高的一個重要原因是乳腺癌細胞很容易發生轉移[6]，因此提高乳腺癌5年存活率的一個重要靶點就是抑制乳腺癌細胞的轉移。癌細胞屬于上皮細胞來源，然而在腫瘤發展過程中腫瘤細胞逐漸失去上皮細胞特征并獲得間充質細胞特性，這一過程稱之為上皮細胞間質轉型（EMT）[7]。EMT是腫瘤侵襲轉移的關鍵過程，是腫瘤的發展和致死的關鍵因素[8]。在EMT過程中，腫瘤微環境中的TGF-β是重要的調節因子，腫瘤的侵襲能力依賴于TGF-β的信號轉導通路，當TGF-β與Ⅱ型TGF-β受體結合后激活Ⅰ型TGF-β受體，Ⅰ型TGF-β受體是一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，它能進一步使轉錄因子Smads2和Smads3發生磷酸化激活，進而上調間充質細胞骨架蛋白如波形蛋白（vimentin）及基質金屬蛋白酶-9（MMP9）等促進腫瘤細胞侵襲正常組織并發生腫瘤轉移[9-11]。在本研究中，為了進一步研究水飛薊賓是否能抑制乳腺癌細胞的侵襲轉移，作者將MCF-7細胞置于transwall上室中，并在上室培養基中加入適量TGF-β以模擬腫瘤生長的微環境。由于腫瘤在實際生長過程中會由于營養供應的限制，發生“饑餓”現象，因此上室培養基為無血清培養基，而在下室培養基中加入10%胎牛血清，腫瘤細胞會因此從低營養的上室往下室“遷移”[12]。

作者發現水飛薊賓加入MCF-7細胞的培養體系后，MCF-7的轉移能力受到顯著抑制。這一實驗結果表明水飛薊賓不僅可以抑制乳腺癌細胞的增殖，更能抑制它們對周期組織進行侵襲和轉移。為了研究水飛薊賓抑制MCF-7細胞轉移能力的分子機制，作者將MCF-7細胞用飛薊賓處理后，用Western blot方法檢測細胞轉移相關蛋白vimentin和MMP9的表達水平，結果發現水飛薊賓能顯著降低乳腺癌細胞轉移相關蛋白vimentin和MMP9的表達水平，提示水飛薊賓可能通過下調MMP9和vimentin的表達從而抑制TGF-β誘導的腫瘤侵襲轉移。

有文獻報道很多天然藥物具有十分顯著的抗腫瘤作用，并且有高效、低毒、高腫瘤選擇性的特點，有很大的研究價值[13，14]。水飛薊賓是一種天然藥物，在臨床上已經大量應用，證實了它的低毒低副作用特性，而本研究則發現水飛薊賓還具有十分良好的抗乳腺腫瘤細胞增殖的生物活性，此外，水飛薊賓還能顯著抑制TGF-β誘導的腫瘤侵襲效應，表明水飛薊賓能減少乳腺癌細胞的侵襲和轉移，對乳腺腫瘤患者的預后起到十分積極的作用。這些研究提示了水飛薊賓可能在人乳腺癌治療中有廣闊的應用前景。

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（收稿日期：2015-03-11）