TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達及意義

牛蕾 雷麗

[摘要] 目的 研究TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達，揭示其在乳腺癌中的信號轉導通路。 方法 應用免疫組化SABC法檢測62例乳腺癌組織中TGFβ1與Smad2/3的表達情況，利用SPSS19.0統計學軟件分析TGFβ1與Smad2/3的差異性及相關性。 結果 TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中呈高表達，陽性表達率依次為69.35%（43/62）和40.32%（25/62）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達與年齡無關，TGFβ1與Smad2/3在組織學分級、病理學分類、TNM分期方面差異均有統計學意義（P<0.05）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達呈正相關（r=0.261，P<0.05）。 結論 乳腺癌的發生可能與TGFβ1及Smad2/3信號轉導途徑發生異常，致使下游信號Smad2/3突變，增加瘤細胞與細胞外基質的相互作用、抑制免疫系統、增加血管形成等機制促進乳腺癌的浸潤和轉移有關。

[關鍵詞] 乳腺癌；TGFβ1；Smad2/3；相關性

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）17-0011-03

轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGFβ）是一族能引起細胞產生表型變化、具有多種生物學功能的蛋白多肽，可調節多種正常細胞或瘤細胞的生長分化。目前研究[1，2]表明：TGFβ/Smads信號途徑不僅在細胞及生物體生長和發育過程中起重要作用，而且與人體腫瘤的發生、發展有密切關聯。TGFβ/Smads信號轉導途徑中一旦發生異常就可引起信號轉導紊亂，從而導致腫瘤的發生[3]。所以探討TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達，有利于揭示其在乳腺癌中的信號轉導通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取阜新市中心醫院2004～2014年間62例乳腺癌存檔標本。患者年齡27～78歲，平均49歲。組織學分級按照Elston等[4]提出的Bloom-Richardson分級（即Nottingham分級），對每例乳腺癌組織從腺管形成、核分裂數和癌細胞異型性3個方面進行評分，按所得總分進行分級：3～5 分為Ⅰ級，6～7 分為Ⅱ級，8～9分為Ⅲ級，Ⅰ級14例，Ⅱ級25例，Ⅲ級23例。病理學分類方法參照WHO1981年制定的乳腺癌分類[5]：導管內癌8例、浸潤性導管癌48例、浸潤性小葉癌4例、浸潤性特殊癌2例。根據國際抗癌聯盟（UICC）關于TNM分期方法[6]進行臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期32例，Ⅳ期8例。

1.2 試劑及方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人TGFβ1多克隆抗體，鼠抗人Smad2/3多克隆抗體（美國，Santa Cruz），SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 方法 應用免疫組織化學染色SABC法觀察TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達分布情況。切片常規脫蠟至水，浸入枸櫞酸鹽緩沖液，然后微波加熱15 min，室溫冷卻后PBS沖洗3次；用3%H2O2室溫（10 min）滅活內源性酶，PBS沖洗3次；濕盒內滴加5%BSA封閉液，室溫（20 min）甩去多余液體，不洗；滴加稀釋度為1∶100的一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃下30 min，PBS沖洗3次；滴加試劑SABC，37℃下30 min，PBS沖洗4次（以上PBS濃度均為0.01 mol/L）；DAB顯色，室溫控制反應，蒸餾水充分洗滌；蘇木素輕度復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色流程均設有對照作為染質量控制標準。陽性對照用Santa Cruz公司已證實的陽性TGFβ1與Smad2/3切片為對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，至少由2名有經驗的病理醫師獨立觀察切片。

1.2.3 結果判定 在200倍視野下隨機選取5個視野，記數每個視野中腫瘤上皮細胞的染色情況，取平均值。TGFβ1與Smad2/3陽性著色位于細胞質中呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。根據瘤組織中陽性細胞的有無及數量，將其分為陰性（-）：未見陽性細胞；弱陽性（+）：陽性細胞少于10%；陽性（++）：陽性細胞11%～30%；強陽性（+++）：陽性細胞多于30%[7]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件包進行數據分析，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中陽性表達的差異性，Spearman相關分析TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中陽性表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織TGFβ1與Smad2/3的表達情況

TGFβ1主要表達在細胞漿，呈棕褐色顆粒狀（封三圖1）。Smad2/3主要彌漫分布于細胞漿和細胞核，呈棕褐色顆粒狀（封三圖2）。表1 TGFβ1的陽性表達率為69.35%（43/62），Smad2/3的陽性表達率為40.32%（25/62）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達與年齡無關（P>0.05），TGFβ1與Smad2/3在組織學分級、病理學分類、TNM分期組中的表達差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 乳腺癌中TGFβ1與Smad2/3之間的關系

TGFβ1與Smad2/3均陽性為21例（33.87%）；TGFβ1陽性/Smad2/3陰性者22例（35.48%）；Smad2/3陽性/TGFβ1陰性者4例（6.45%）；TGFβ1與Smad2/3均陰性為15例（14.19%）；TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達存在正相關（r=0.261，P<0.05），見表2。

3討論

乳腺癌的發生是由多種異常癌基因和抑癌基因共同作用的積累。癌基因的激活和抑癌基因的失活導致宿主代謝發生改變，細胞信號轉導失常，從而導致細胞異常分裂誘導癌變，這是腫瘤發生的根本原因[8]。

TGFβ至少有6種異構體形式，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，有60%～80%的序列同源[9]。各種異構體在許多生物反應中表現出相似的作用，其中TGFβ1最為重要，是人體內主要的存在形式，且具有抑制早期腫瘤發生和促進晚期腫瘤遷移擴散的作用[10，11]。Smad是Mad和Sma蛋白及其類似物的統稱，即Smad（Sma-Mad）族蛋白。迄今為止，在哺乳動物已經分離鑒定的Smad 蛋白共有9種，作為TGFβ家族受體激酶的直接底物，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。Smad1、Smad5和Smad8主要通過BMP受體磷酸化，介導BMP反應。Smad2和Smad3被TGFβ受體磷酸化，轉導TGFβ和活化素的信號。Smad4是通用型蛋白，參與Smad2和Smad3介導的信號傳導。Smad6和Smad7的功能是抑制受體激動的Smads蛋白介導的信號轉導，Smad6和Smad7可以阻斷TGF-β介導的轉錄反應，有研究發現Smad7較Smad6的抑制作用更為明顯[12]。

本研究證實：TGFβ1主要表達于細胞漿，Smad2/3主要彌漫分布于細胞漿和細胞核，這與Shen N等[13]研究一致，Smad2和Smad3作為TGFβ1的下游信號轉導因子，轉導TGFβ1的信號。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達與年齡無關，這可能是不同年齡的乳腺癌中TGFβ1與Smad2/3信號轉導途徑已經發生異常，過表達的TGFβ1未能有效抑制腫瘤發生，致使下游信號Smad2/3突變，參與了促進腫瘤發生和擴散的作用。而在組織學分級、病理學分類、TNM分期中TGFβ1與Smad2/3陽性表達與陰性表達存在差異性，且TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達存在正相關，說明在不同組織學分級、病理學分類、TNM分期狀態下，腫瘤的浸潤程度及轉移程度變化可能是在TGFβ1與Smad2/3信號轉導途徑下發生的，其機制可能為TGFβ1活化后與細胞膜表面Ⅱ型受體結合，同時激活TβRⅡ磷酸化激酶，TβRⅠ識別此復合物并與之結合，又被TβRⅡ磷酸化激酶磷酸化而激活，作用于胞質內下游分子，開啟信號的傳導，激活Smad2和Smad3，將信號轉導到細胞內，并作為轉錄因子單獨或與其他DNA結合蛋白結合后激活靶基因，從而影響信號轉導，增加瘤細胞與細胞外基質的相互作用、抑制免疫系統、增加血管形成等機制來促進乳腺癌的浸潤和轉移，同時也說明了組織學分級、病理學分類、TNM分期狀態在臨床應用的重要性和必要性[14]。TGFβ/Smads信號轉導路徑過程中可能還伴發著其他信號轉導因子的調節和其他細胞因子的參與，但目前學術界基本認為其表達水平與腫瘤的發生存在正性的聯系。有研究表明[15]，TGFβ1在多種腫瘤細胞中過度表達，抑制腫瘤生長，當腫瘤細胞耐受TGFβ1介導的生長抑制作用后，表現為TGFβ/Smads信號轉導途徑的異常，致使下游信號Smads突變及癌基因突變。Massague等[16]認為，TGFβ1通過上調或下調其細胞內信號轉導分子的表達水平，以一種自身反饋調控機制在其信號終止過程中發揮重要作用。信號被細胞內信號分子從胞漿轉導至細胞核內發揮作用后，TGFβ1信號需要減弱并終止，以求細胞對TGFβ1刺激反應的強度和持續時間得到精確控制。

綜上所述，TGFβ/Smads信號轉導途徑是我們揭示腫瘤發生過程的一條非常重要線索，其中通用性Smad4在乳腺癌發生中與TGFβ1和Smad2/3之間的關系還有待我們進一步研究。

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（收稿日期：2015-03-19）