基于TRIZ原理的滅活疫苗中抗原空間表位的創新應用

張琳等

摘 要：TRIZ是技術和產品創新一種重要方法，已在農機裝備、農業金融、農產品加工等農業領域成功的進行了應用，但獸醫領域尚未嘗試。本研究基于TRIZ原理，應用系統分析、三軸分析和矛盾分析對滅活疫苗生產過程中病原蛋白質的破壞問題進行了剖析，創新性提出了利用抗原空間表位建立滅活疫苗安全性檢驗的新方法，反向指示疫苗是否安全的新思路。研究結果證實，TRIZ理論完全可以在獸醫領域中應用，能夠為技術難題提供新思路和方案。

關鍵詞：TRIZ原理；滅活疫苗；抗原空間表位

引言

滅活疫苗是我國目前制備工藝成熟、使用廣泛、安全有效的疫苗，它以病原為基本物質，與滅活劑充分作用后加入佐劑制成，一方面因病原抗原表位的存在可以刺激機體產生抗體達到清除病原的目的，另一方面因病原的核酸與蛋白完全失活保證了使用與環境的安全，所以被廣泛應用于多種疾病的預防。在病原確定的情況下，滅活疫苗制備的關鍵步驟是滅活，只有完全滅活的安全疫苗才能進行應用。但滅活的過程中破壞了病原蛋白的活性，致使疫苗產生的效力有所損失，同時蛋白活性作用無從體現。所以，在滅活疫苗生產中如何避免蛋白構象的破壞和實現蛋白的創新利用，本研究嘗試利用TRIZ進行探索。

TRIZ理論全稱為“發明問題解決理論”，是一種指導創新的方法論[1]。TRIZ理論產生于工程技術領域，主要解決泛制造業的技術難題。但隨著理論的發展和逐步完善，逐步向企業管理、政治、教育、服務的非技術領域延伸。近年來，在科技部等四部委的倡導下，TRIZ理論在農業領域也迅速鋪開，已在農機、農業金融、農產品加工等領域進行了嘗試，為諸多技術難題的攻關提供了方案或者思路。對于TRIZ理論能否在獸醫領域應用，文章將首先在滅活疫苗抗原空間表位的應用上進行嘗試，探索全新高效的利用方案。

1 TRIZ理論簡介

TRIZ理論是前蘇聯科學家阿奇舒勒[2]在研究了大量的專利后發現不同的發明在使用了相同的原理和解決方法，并且產品和技術系統是按照一定規律去發展的，在此基礎上他創立了TRIZ理論。TRIZ理論有幾個最重要的組成部分[3]——技術系統、資源、矛盾，這也是解決問題流程中的基礎部分。技術系統是TRIZ提出問題時所選擇的對象，系統可大可小，任何系統又包括一個或多個子系統，在系統之外則是超系統；系統確定分析后需要進行資源分析，系統資源可分為自然、時間、空間、系統、物質、能量場、信息和功能八類；矛盾是一個系統存在的難以解決問題的根源，可分為技術矛盾和物理矛盾。

在問題定義和轉化為TRIZ工程問題后，TRIZ提供了三種重要方法和工具[4]：一是創新原理，用于消除技術矛盾，共40條，并形成矩陣。當問題確認為技術矛盾后，可根據矛盾選擇工程參數，然后找到創新原理來消除矛盾。二是分離原理，當矛盾為物理矛盾時，采用分離原理來解決，主要有從時間、空間上分離，部分與整體分離等方法。三是物場模型，一個功能必須同時具有三個基本元件才能存在，三者分別為兩種物質和物質間相互作用的場。物場模型可以用來發現系統中的結構化問題，解法為76種標準解。（見圖1）

2 問題提出與TRIZ模型分析

2.1 問題的定義和分析

TRIZ對于問題的解決是從系統的確定開始的。上文提到系統的選擇可大可小，但范圍的選擇至關重要，如系統選擇過小，則系統內子系統過少或者沒有，相互之間的關系和功能缺乏，造成解決方法過少；如系統選擇過大，則系統內子系統過多而超系統少，內部關系復雜難以完整分析。在本研究中選擇滅活疫苗為技術系統，組建組件模型和確定功能關系，如下圖所示。

其中滅活劑為超系統組件，疫苗為作用對象。在該組件系統中，定義存在問題的功能關系有兩個，即“滅活劑-破壞-有害”和“佐劑-包裹-不足”。佐劑的內容較為復雜，做另文發表，這里針對“滅活劑-破壞-有害”這一問題進行解決方案的探索。

問題定義和系統分析后進行三軸分析。三軸分析是從因果軸、操作軸和資源軸出發，分析當前技術問題的根本原因和解題資源，達到以最低成本解決問題的目的。針對滅活劑的破壞作用，首先進行因果分析。目前疫苗生產中廣泛應用的滅活劑是甲醛，在滅活過程中，主要是滅活病原的蛋白質及包裹在內的核酸。滅活進行時，甲醛首先作用于核酸，與腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的堿基結合而使病毒核酸變性。當甲醛繼續作用，就與蛋白質的胺基結合，形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，而后再與酰胺發生交聯反應，致使蛋白質變性，并阻止核酸的逸出。所以，甲醛滅活蛋白發生在核酸滅活之后，蛋白質變性才能保證疫苗的完全滅活。蛋白質由氨基酸組成，能夠激活免疫系統的氨基酸稱為抗原表位（抗原決定簇），表位依據形態又可分為線性表位和構象（空間）表位。空間表位因其存在的位置和構象，往往能比線性表位更好地被免疫系統識別，產生特異性抗體。但滅活劑發生作用時，空間表位隨之被破壞，形成線性表位的狀態或者失去蛋白活性，而線性表位因本身長度較短的線性狀態則基本不受影響，所以滅活劑的有害作用根本原因是破壞了空間表位的構象。由此可見，滅活疫苗的滅活對象關鍵組分是蛋白的空間表位。

在因果分析中找到了問題的根本所在，在資源軸上考慮能否不使用滅活劑或者換成其他的滅活劑（如BPL、BEI）解決因空間表位被破壞而損失疫苗免疫效價的問題。但因安全、成本和適用范圍的原因不是最合適的方案。

在目前的生產中，滅活雖然破壞了蛋白空間表位，損失了疫苗產生的效價，但以安全為前提的情況下，空間表位的作用被忽略了。根據三軸分析的結果，針對滅活劑對空間表位的破壞作用，如何在保證安全的前提下降低空間表位的破壞和高效利用，設計出一個初步方案：調整甲醛的工作時間和濃度，減少對于空間表位構象的破壞程度。

運用TRIZ理論進行發明、創新的關鍵是找出矛盾，并分析技術矛盾或物理矛盾，然后運用TRIZ的解題工具找出解決矛盾的思考方向。對于初步方案的分析，得到一對技術矛盾，雖然減少了滅活劑對空間構象的破壞，但疫苗的安全性無法得到保障。對照TRIZ矛盾矩陣，這對矛盾改善了“作用與物體的有害因素”卻惡化了“可靠性”。查找矛盾對應的創新原理有四個，分別為廉價替代品原理、借助中介物原理、抽取原理和復合材料原理。其中抽取原理為問題的解決提供了新的思路。抽取原理的內容有兩條：一是從物體中抽出產生負影響的部分或屬性，二是從物體中抽出必要的部分或屬性。對應到滅活劑破壞病原蛋白空間表位的問題上，既然滅活疫苗以安全為首要目標，必須進行病原的完全滅活，解決方案應轉變思路，將蛋白空間表位抽提出來，作為滅活疫苗是否安全的指示系統，建立滅活疫苗滅活是否完全的檢測新方法，實現空間表位的高效利用。

2.2 解決方案的設計

2.2.1 總體方案

利用TRIZ分析獲得的方案，以滅活疫苗滅活中間產品蛋白空間表位的破壞為標準，建立滅活疫苗滅活程度的檢驗方法，即安全性檢驗新方法。新方法集成了疫苗滅活、蛋白結構、免疫學檢測的相關技術，不僅解決了空間表位的創新利用，而且與現行滅活疫苗安全性檢驗方法相比，有三個突出特點：一是提高了檢測精度，變定性檢測為定量檢測；二是縮短了檢測時間，整個檢測過程最多只需24小時；三是提高了檢測的準確性，利用免疫學技術糾正肉眼不易觀察的病變。

2.2.2 方案基礎

（1）滅活。如因果分析所述，目前疫苗生產中廣泛應用的滅活劑是甲醛，甲醛滅活蛋白發生在核酸滅活之后，蛋白質的變性能夠作為滅活完全的標志。（2）抗原表位。同樣如因果分析所述，空間表位存在與否與蛋白是否變性是一致的，能夠作為滅活完全的判定標準。（3）空間表位的確定。肽掃描技術、氨基酸突變、X-ray、質譜、噬菌體展示等均可用于空間表位的篩選[5]。利用這些方法，能夠簡單可靠的確定大多數病毒主要抗原蛋白的空間表位，用于相關研究，保證了利用空間表位檢驗滅活疫苗安全性成為可能。（4）ELISA檢測技術。免疫學檢測常用技術，以抗原抗體反應為基礎。利用基因工程技術對空間表位或其所在蛋白進行可溶性表達，以保證制備的蛋白具有天然構象。隨后使用蛋白進行動物免疫，制備相應的單克隆或者多克隆抗體，從而建立雙夾心ELISA檢測方法。通過滅活原理和抗原表位的分析，明確了空間表位在滅活過程中的作用，然后結合ELISA技術完成安全性的檢測。

2.2.3 應用示例

以Lasota株滅活疫苗滅活程度的檢測為例。在生產中以雞胚接種尿囊腔的方式進行病毒的增殖，隨后收集尿囊液以甲醛為滅活劑進行滅活。利用肽掃描技術發現，HN蛋白163-569位氨基酸包含的7個抗原表位均為空間表位。以HN 163-569位氨基酸為目的蛋白，應用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統為表達媒介進行蛋白的表達，獲得具有天然構象的蛋白。將蛋白純化后免疫小鼠三次，采血分離血清制備多克隆抗體。制備抗體后建立檢測新城疫病毒的雙夾心ELISA方法。應用的特異性NDV HN抗體和酶標的NDV HN抗體為制備的多克隆抗體。最后通過分光光度計測定OD450的值，結合陰陽性對照，最終確定待檢樣品的滅活程度。如檢測結果為陽性，則表明滅活中間品未滅活完全，結果為陰性時，則滅活中間品滅活完全。整個檢測過程可在24小時內完成。

疫苗滅活過程中對空間表位的破壞是不可避免的，使原本可以有效激發機體免疫的主要組分不能發揮作用，在這種情況下如何合理運用、充分發揮空間表位的作用，TRIZ提供了新的思路：一是利用抽提原理將空間表位分離出來加以利用，在破壞不可避免的情況下變害為利，結合分子生物學、免疫學等技術建立新的檢驗疫苗安全性的方法，用以指示疫苗是否滅活完全；二是解決了目前疫苗安全性檢測方法的缺點。現行滅活程度的檢驗一般通過接種對本毒敏感的細胞、禽胚或實驗動物，根據病變或死亡狀況進行判定，需花費多達5-6天的時間，耗時長且中間操作過程要求嚴格。傳統的方法在要求生產效率提升和科技創新的背景下已不合時宜。TRIZ原理提供的新方法解決了以上不足。

3 結束語

滅活疫苗的問題雖小，但說明TRIZ理論完全可以在獸醫領域進行應用，為科研和技術難題的攻關提供新思路和方案。這是TRIZ理論在獸醫領域應用的一次有益嘗試，也為在農業領域的全面應用提供了借鑒。

參考文獻

[1]丁俊武，韓玉啟，鄭稱德.創新問題解決理論-TRIZ研究綜述[J].科學學與科學技術管理，2004，11：53-60.

[2]Nakagawa T. Education and training of creative problem solving thinking with TRIZ/USIT[J]. Procedia Engineering， 2011，9：582-592.

[3]井輝，郇志堅.基于TRIZ的復雜管理問題求解模式研究[J]. 科學學與科學技術管理，2005，11：155-159.

[4]郭 ，張峭，趙思健，等.基于TRIZ原理的農村中小企業貸款難解決方案研究[J].中國科技論壇，2014，4：123-128.

[5]文雪霞，陳化蘭，熊永忠，等.抗原表位鑒定方法的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2012，39（7）：66-70.

作者簡介：張琳（1984-），男，山東濟南人，山東省農業科學院畜牧獸醫研究所助理研究員。