腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對非小細胞肺癌細胞凋亡誘導的實驗研究

王建新

[摘要] 目的 研究腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）對非小細胞肺癌腫瘤細胞體外誘導凋亡作用，探討TRAIL治療肺癌的可行性。 方法 （1）單用組：單用不同濃度的TRAIL溶液處理A549并與白血病Jurkat細胞對照；（2）聯合組：相同濃度的TRAIL聯合不同化療藥物處理A549并與對應的單純化療藥物對照，用MTT法及流式細胞儀檢測處理前后A549細胞的凋亡發生率并比較。 結果 TRAIL溶液能使部分體外非小細胞肺癌發生凋亡，TRAIL溶液濃度與細胞凋亡率在一定程度上呈正相關；聯合化療藥物后的TRAIL溶液對腫瘤細胞殺滅能力顯著強于單用化療藥物組，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 TRAIL可誘導小部分非小細胞肺癌細胞體外凋亡，其凋亡作用在一定范圍內與TRAIL濃度呈正相關，TRAIL聯合常用化療藥物有協同促進腫瘤細胞凋亡的作用。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；凋亡

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）14-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of TNF-related apoptosis inducing ligand （TRAIL） in inducing apoptosis in non-small cell lung cancer， and to explore the feasibility of TRAIL in treatment of lung cancer. Methods The single group： the cells in the two group with solutions of different concentrations of TRAIL A549 and the feasibility of TRAIL treatment between the NSCLC group and the Jurkat leukemia cell group was compared. The combination group： same concentrations of TRAIL combined with different chemotherapy treatment A549 and the corresponding chemotherapy drugs were compared， apoptosis was detected by MTT assay before and after treatment of A549 cells the incidence of parallel statistical comparison. Results TRAIL was able to make part of the non-small cell lung cancer apoptosis in vitro， TRAIL apoptosis rate and concentration had a positive correlation to some extent； TRAIL solution after combination chemotherapy drugs kill tumor cells was significantly stronger ability to eliminate drugs in the chemotherapy alone， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion TRAIL can induce lung cancer cells in vitro， small portion of non-small cell apoptosis of apoptosis within a certain range of concentrations are positively related with TRAIL， TRAIL combined chemotherapy drugs have synergistic apoptosis of tumor cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand； Apoptosis

惡性腫瘤的發病率越來越高，在包括手術切除、放療、化療等治療方式但療效又令人不甚滿意的大背景下，需要尋找新的有效治療的思路和手段。利用腫瘤壞死因子治療惡性腫瘤是目前研究的熱點之一，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年來發現的腫瘤壞死因子（TNF）超家族中的又一成員，但與TNF家族成員TNF和FasL的高毒性不同，TRAIL能夠選擇性的介導多種腫瘤細胞凋亡，卻不介導正常細胞凋亡[1]。這一特性使其在腫瘤治療領域前景廣闊，也是近年來研究較熱的主要原因。非小細胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的75%～80%[2]，幾乎所有的NSCLC患者在病程的不同時期均需要接受藥物化療，費用昂貴，且有骨髓移植、肝腎功能損害等毒副作用，若能利用TRAIL靶向對抗腫瘤細胞可解決這一難題。本次實驗主要研究體外TRAIL試劑對NSCLC細胞株A549的誘導凋亡作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人NSCLC細胞株A549由哈爾濱醫科大學第二附屬醫院呼吸內科實驗室惠贈，人T細胞株Jurkat購于ATCC，順鉑、阿霉素、紫杉醇分別為Bristol-Myers Squibb、Pharmacia&Upjohn、Immunex公司產品，TRAIL溶液購于三博遠志生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 細胞解凍后，RPMI1640培養基上傳代培養6代，轉移分組，每組細胞濃度約為1×105個/mL，觀察至對數生長期后，計數細胞濃度后將細胞按每孔1×104個/200 μL接種于96孔板，繼續培養24 h。

1.2.2 TRAIL溶液及藥物處理 ①單用組：A549細胞貼壁生長后加入新鮮配制的含不同濃度的TRAIL（1、10、100、1000 μg/L）培養液，對照組為同濃度的培養液添加到貼壁生長的Jurkat細胞培養基中，兩組均置于37℃ CO2培養箱中24 h；②聯合組：聯合化療藥物組取含100 μg/L TRAIL的培養液3份9 mL，分別加入阿霉素（5 μmol/L）、順鉑（10 μmol/L）、紫杉醇（5 μmol/L）1 mL，混合后用于培養A549貼壁細胞；單用化療藥物組為不含TRAIL的培養液加入上述3種同等濃度劑量的藥物后，培養A549貼壁細胞，均置于37℃ CO2培養箱中培養24 h。

1.2.3 細胞活性檢測 每個培養基均分為兩組，一組用MTT法測定細胞活性，另一組用流式細胞儀測定凋亡率，分別取上述每個培養基中細胞1×106個，經pH 7.4、0.01 mol/L的PBS溶液洗滌后，70%低溫乙醇4℃固定48 h，采用MTT法測定細胞活性；另一組經上述洗滌、固定、并行碘丙啶染色后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學處理

結果均由3次重復實驗獲得，采用SPSS 18.0軟件包進行統計學處理，計量資料以（x±s）形式表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

MTT法與流式細胞儀檢測細胞活性統計結果表現一致，存在線性相關，與同類統計相符，說明此次統計結果可靠。

2.1 單用組兩組細胞凋亡率比較

單用組A549細胞總體凋亡率低于白血病Jurkat細胞，隨著TRAIL濃度的升高，NSCLC細胞凋亡也升高，在一定程度上呈正相關，見圖1、2。

2.2 聯合組兩組細胞凋亡結果比較

TRAIL聯合化療藥物處理A549細胞株與單用化療藥物組相比，細胞凋亡率更高，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

3 討論

人類TRAIL基因定位于3號染色體的3q26，其mRNA廣泛表達于外周血單核細胞（PBMC）、肺、卵巢、腸管等多種器官組織中，但不表達于人腦、肝臟和睪丸[3]。TRAIL是由281個氨基酸組成的典型Ⅱ型跨膜蛋白，其N端（胞內區域）沒有信號肽，第15～40位氨基酸為疏水區域，形成跨膜結構，胞外C末端的114～281位氨基酸為其活性部位，機體內的蛋白酶能夠將這部分胞外氨基酸鏈水解成可溶性單體，可溶性單體可與TRAIL受體結合，發揮生物效能。

提及TRAIL受體，目前發現的人TRAIL受體共5個，包括4個非可溶性細胞膜受體（2個死亡受體、2個誘騙受體）和1個可溶性受體[4]。2個死亡受體分別是死亡受體4（death receptor 4，DR4）和死亡受體5（DR5），均為Ⅰ型跨膜蛋白，上文所述的TRAIL胞外氨基酸被蛋白酶水解為可溶性單體，3個可溶性單體通過Cys230螯合一個鋅離子，形成有活性的同源三聚體，同源三聚體可與DR4/DR5結合，進而誘導細胞凋亡。

有研究用Northern雜交發現[5]，兩種死亡受體DR4/DR5 mRNA的組織表達范圍與TRAIL相似；并且國內王績英等[6]的實驗證實，在非小細胞肺癌組織中DR4、DR5均為陽性表達。這兩項實驗結果的發現為TRAIL治療惡性腫瘤，特別是對抗非小細胞肺癌奠定了生物學基礎。本次實驗單用組結果：TRAIL體外誘導非小細胞肺癌凋亡，總凋亡率低于對白血病Jurket細胞的凋亡率。白血病Jurket細胞TRAIL死亡受體的陽性表達，在TRAIL研究領域已是共識，這也是眾多研究TRAIL誘導惡性腫瘤凋亡實驗選用Jurket細胞作為對照的原因所在。分析實驗結果，體外環境下NSCLC細胞對TRAIL的敏感性不及Jurkat細胞，原因可能有以下3點：①兩種細胞死亡受體表達程度不同[7]，Jurkat細胞DR4、DR5的表達率高于NSCLC細胞；②兩者均在體外實施誘導實驗，TRAIL誘導兩者體內凋亡對內環境的需求至今尚未闡明，若存在需求不同，而體外為同一環境，可能存在對兩者凋亡的不平衡性因素；③NSCLC細胞為實體腫瘤組織細胞，人白血病Jurkat為非實體腫瘤細胞，兩者本身特性及生存能力存在差異[8]。

實體腫瘤細胞凋亡信號傳導有兩種主要方式：一是前文所述的死亡受體途徑，另一個是線粒體途徑。臨床上常見的經典抗腫瘤藥物作用機制主要涉及線粒體途徑。但是這兩種信號途徑并不完全獨立，Caspase的序貫激活是細胞凋亡的特征性變化[9]，Caspase存在多種亞型，功能不一，Caspase8、Caspase10是啟動型，Caspase3、Caspase6為效應型代表，其中在細胞凋亡過程中，效應型Caspase3作用最為重要，它是死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑中多種Caspase的共同底物[10]，聯合兩種途徑的同時酶切及幾乎所有的胞內結構蛋白，保證凋亡的不可逆轉性。施敏驊等[11]的實驗證實抗腫瘤藥物處理后的NSCLC細胞中Caspase3活性在基礎水平上有明顯提高，且有濃度依賴關系。本次實驗中聯用組結果顯示，采用TRAIL聯合常用腫瘤藥物處理NSCLC細胞凋亡率明顯高于單用抗腫瘤藥物處理的結果，差異有統計學意義（P<0.05）。其原因可能是TRAIL與抗腫瘤藥物通過兩種途徑分別激活不同的Caspase，并級聯合放大有關凋亡信號，因而對腫瘤細胞凋亡產生了更為強烈的協同作用[12]。這是研究者們所期待的，也是TRAIL在抗腫瘤領域應用前景廣闊的原因所在。本次實驗旨在研究TRAIL對腫瘤細胞的凋亡作用，對不同種類抗腫瘤藥物作用結果的不同未作統計學對比及闡述。

綜上所述，本研究結果顯示TRAIL能夠在體外誘導部分NSCLC細胞凋亡，并與常用的抗腫瘤藥物存在協同關系。但畢竟是體外實驗，體內內環境的復雜性對TRAIL選擇性殺傷NSCLC細胞有何影響還有待闡述，但有利的是NSCLC細胞存在允許TRAIL發揮凋亡作用的死亡受體，并且TRAIL與抗腫瘤藥物在對抗腫瘤方面有協同作用。這些特性使TRAIL有望在靶向治療NSCLC及耐藥性NSCLC[13]方面取得突破。

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（收稿日期：2014-11-04）