白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織Txnip、Trx與ASK1表達的調節作用

王 喆，吳永貴，章超群，武曉旭，徐興欣，王 坤

白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織Txnip、Trx與ASK1表達的調節作用

王 喆，吳永貴，章超群，武曉旭，徐興欣，王 坤

目的了解白芍總苷（TGP）對糖尿病大鼠腎組織硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）、硫氧還蛋白（Trx）與凋亡信號激酶1（ASK1）表達的影響，探討TGP對糖尿病腎組織Trx系統調節作用。方法將鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠隨機分為模型組、TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組，另取正常大鼠為對照組，8周后測定大鼠尿白蛋白排泄率（UAER）。應用免疫組化、Western blot法及實時定量PCR法檢測大鼠腎組織Txnip、Trx與ASK1表達。結果實驗8周后TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對照組大鼠UAER水平均低于模型組（P＜0.01）；免疫組化和（或）Western blot法顯示TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對照組大鼠腎組織Txnip、ASK1表達低于模型組（P＜0.05，P ＜0.01），而Trx高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；實時定量PCR顯示TGP［50、100、200 mg／（kg·d）］給藥組及對照組Txnip mRNA低于模型組（P＜0.01，P＜0.05），Trx mRNA高于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。結論糖尿病腎病大鼠腎組織存在Trx系統異常，TGP對糖尿病大鼠腎組織保護作用可能與抑制Txnip表達、提高Trx表達有關。

糖尿病腎病；硫氧還蛋白；ASK1；白芍總苷

研究［1］表明氧化應激參與糖尿病腎病的發生及發展。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統是機體一種對抗氧化應激、維持氧化還原反應的平衡系統。Trx是細胞內主要的抗氧化劑，其作用在于減少活性氧生成，另外其還原形式可抑制凋亡信號激酶1 （apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的活性，從而抑制ASK1依賴性的凋亡。Trx相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，Txnip）作為Trx功能和表達的負性調節因子，下調Trx表達，其平衡紊亂可導致氧化還原體系的失調，進而加劇氧化應激［2］。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是一種從白芍干燥根中提取的有效物質，主要作用有抗氧化、免疫調節與抗炎［3］。研究［4］表明TGP對糖尿病腎病有明顯保護作用，其機制部分與抗氧化應激有關，但其對于Trx系統的作用尚不明確，該研究進一步觀察TGP對糖尿病大鼠腎組織Trx、Txnip及ASK1表達的影響，旨在探討TGP對糖尿病腎組織Trx系統的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Munich-Wistar大鼠50只，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，昆明種，體重180～200 g。

1.1.2 藥品與試劑 TGP由安徽醫科大學臨床藥理研究所魏教授贈予，使用前先將TGP溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司）；尿白蛋白測定試劑盒（法國SPI公司）；Trx、Txnip、內參GAPDH引物及探針（上海生工公司）；M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑（美國Promega公司）；Tag酶及MgCl2（美國Roche公司）；TRIzol試劑（美國Life Technologies公司）；Txnip、Trx及ASK1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根酶標記山羊抗兔／小鼠IgG（武漢博士德公司）；免疫組化檢測試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；ECL增強發光試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；硝酸纖維膜（美國Amersham公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養條件 實驗前所有大鼠于12 h光照、12 h黑暗的光照周期、室溫（22±2）℃、相對濕度（55±5）%環境中適應飼養1周。實驗期間正常飲食，每日更換敷料，不應用胰島素，觀察8周。

1.2.2 動物分組及模型制備 將適應飼養1周的實驗大鼠隨機均等分成：對照組、模型組、TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組。STZ用前先將其溶于0.01 mmol／L枸櫞酸緩沖液中，使其pH達到4.5；模型組及TGP給藥組大鼠腹腔一次性注射STZ 65 mg／kg，對照組則注射等量枸櫞酸緩沖液。48～72 h后于尾靜脈采血，應用血糖儀測定全血血糖，血糖在16.7 mmol／L以上者確定為糖尿病模型。

1.2.3 標本收集 大鼠處死前1 d用代謝籠準確收集24 h尿液，3 000 r／min離心10 min后分裝，放置于－80℃冰箱中保存，待測尿白蛋白含量。使用戊巴比妥對大鼠進行腹腔注射麻醉，從右側頸總動脈插管，向管中注入生理鹽水反復灌洗腎臟，至整個腎臟顏色變蒼白后去除包膜，并置于冰上，取8 mm3大小腎組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，進行免疫組化研究，剩余腎組織分割成均等大小后分裝到凍存管中，迅速轉移至液氮中以備Western blot及實時定量PCR檢測。

1.2.4 尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）測定 采用ELISA法測定尿白蛋白含量，UAER＝尿白蛋白含量×24 h尿量。

1.2.5 實時定量PCR測定Txnip及Trx的表達使用TRIzol法提取腎組織總RNA，One-Drop核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA質量和濃度，并要求吸光度（absorbance，A）值A260／A280為1.8～2.0，并調整RNA濃度至1 mg／L。Txnip上游引物：5′-TCAGTCAGAGGCAATCACATTA-3′，下游引物：5′-GGAGCCAGGGACACTAACATAG-3′；Trx上游引物：5′-CCTTCTTTCATTCCCTCTGTGA-3′，下游引物：5′-CCCAACCTTTTGACCCTTTTTA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。使用Bio-Rad SYBR Green PCR試劑盒進行PCR檢測，在Bio-Rad Real-Time PCR擴增儀中進行反轉錄及PCR反應，每個樣本均設置3個復孔，計算平均Ct值，按照2－ΔΔCt計算目的基因表達值。

1.2.6 免疫組化測定Txnip、Trx及ASK1的表達大鼠腎組織經甲醛溶液固定及石蠟包埋后制成2 μm厚度的切片，并經多聚賴氨酸處理，將石蠟切片常規脫蠟，滴加3%過氧化氫溶液以抑制內源性過氧化物酶，放置于室溫下孵育15 min。沖洗甩干后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中，并使用微波爐高火加熱10～15 min以修復表面抗原，PBS沖洗后加入山羊血清封閉，37℃孵育30 min，再分別滴加兔抗大鼠Trx多克隆抗體（1∶100）、山羊抗大鼠Txnip多克隆抗體（1∶200）、兔抗大鼠ASK1多克隆抗體（1∶100），使用PBS作為陰性對照組，后放置于4℃冰箱中過夜，第2天，將切片放入37℃溫箱中孵育30 min復溫，PBS沖洗甩干后滴加聚合物增強劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗后加入辣根酶標記山羊抗兔／小鼠IgG多聚體，30℃孵育30 min，PBS沖洗甩干后應用DAB顯色。腎小球免疫組化結果按半定量分析法評分，按染色面積計分：微弱或無染色為0分，染色面積＜25%為1分，染色面積25%～50%為2分，染色面積51%～75%為3分，染色面積＞75% 為4分。腎小管－間質區使用圖像分析軟件，進行陽性目標分割編輯后測算陽性面積占腎小管－間質百分比，取均值。

1.2.7 Western blot法檢測ASK1及Txnip的蛋白表達 取100 mg腎組織及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluorid，PMSF）放入勻漿器中，冰上充分研磨后4℃、12 000 r／min離心30 min，取上清液放入EP管中，并用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量。取30 μg蛋白與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）按4∶1比例混勻，置于100℃水浴5 min，使蛋白變性，10 000 r／min，離心1 min，取出上清液放入EP管中，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制6%～15%PAGE膠，上樣后先用電壓55 V，約45 min，待蛋白電泳至濃縮膠與分離膠交界處時改用電壓110 V，約60～90 min。再將蛋白轉移至NC膜上，提前將脫脂奶粉5 g、PBST 100 ml配制成封閉液，將NC膜放入封閉液中，放在搖床上室溫封閉2 h。洗膜后加入免抗大鼠Txnip（1∶100）；ASK1（1∶100）和β-actin（1∶500）4℃過夜，洗膜后放入辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔／鼠二抗（1 ∶5 000）中孵育，37℃，1 h。洗膜后使用ECL發光試劑化學顯色后曝光并顯影，使用Image J圖象分析系統測定條帶灰度值。β-actin作為內參，取其余組與其比值，計算均值。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，正態分布資料的實驗數據用±s表示，腎小球免疫組化評分為非正態分布資料，用中位數表示。由于UAER為非正態分布資料，故先采用對數轉換后，再用幾何均數×（÷）耐受因子表示。參數資料采用單因素方差分析檢驗。非參數資料采用Krustal-Wallis秩和檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠UAER的變化實驗8周后對照組、模型組、模型＋TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組的UAER水平分別為0.38×（÷）1.3、1.87× （÷）1.1、1.32×（÷）1.1、1.15×（÷）1.1、0.65× （÷）1.1，實驗顯示模型組大鼠UAER明顯高于對照組（P＜0.01），而TGP 50、100 mg／（kg·d）給藥組及TGP 200 mg／（kg·d）給藥組均低于模型組（F ＝5.41，P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 各組大鼠腎組織Txnip表達的變化對照組、模型組、TGP 50 mg／（kg·d）給藥組、TGP 100 mg／（kg·d）給藥組、TGP 200 mg／（kg·d）給藥組腎小球Txnip表達按染色面積計分，評分分別為0（0～1）、2（2～3）、1.5（1～2）、1（0～1）、0.5（0～1），結果顯示模型組腎小球Txnip表達明顯高于對照組（P ＜0.01），TGP 50 mg／（kg·d）及TGP 100、200 mg／（kg·d）給藥8周大鼠腎小球Txnip表達低于模型組（H＝35.231，P＜0.05，P＜0.01），見圖1。Western blot法顯示模型組腎組織Txnip蛋白表達明顯高于對照組（P＜0.01），與模型組比較，TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Txnip蛋白表達明顯降低（F＝30.55，P＜0.05），見圖2。實時定量PCR顯示模型組腎組織Txnip mRNA表達高于對照組（P＜0.01）。TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Txnip mRNA表達低于模型組（F＝111.582，P＜0.05），見圖3。

2.3 各組大鼠腎組織Trx表達的變化免疫組化顯示模型組Trx在腎小球及腎小管－間質的表達明顯低于對照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg ·d）給藥8周大鼠腎小球中Trx表達高于模型組（H＝20.245，P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg· d）給藥組大鼠腎小管－間質中Trx表達也明顯高于模型組（F＝19.446，P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖4。實時定量PCR顯示模型組腎組織Trx mRNA表達明顯低于對照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織Trx mRNA表達高于模型組（F＝14.377，P＜0.05），見圖5。

表1 各組大鼠腎組織免疫組化指標Trx變化（n＝10，±s）

表1 各組大鼠腎組織免疫組化指標Trx變化（n＝10，±s）

a腎小球評分為非參數資料，用中位數表示；與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別劑量［mg／（kg·d）］腎小球a（評分）腎小管－間質（%）對照－2（1～2）25.31±4.01模型－0（0～1）**11.81±3.64**TGP給藥501（0～2）15.65±4.08＃1001（1～2）＃＃19.16±2.15＃＃2001（1～2）＃＃20.17±3.91＃＃

2.4 各組大鼠腎組織ASK1表達的變化免疫組化顯示模型組ASK1在腎小球及腎小管－間質的表達明顯高于對照組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周大鼠腎小球中ASK1表達低于模型組（H＝26.034，P＜0.05，P＜0.01），腎小管－間質中ASK1表達也低于模型組（F＝32.464，P ＜0.05，P＜0.01）。見表2、圖6。Western blot法顯示模型組腎組織ASK1蛋白表達明顯高于對照組（P ＜0.01），TGP 50、100、200 mg／（kg·d）給藥8周腎組織ASK1蛋白表達明顯低于模型組（F＝2 214.085，P＜0.05），見圖7。

表2 各組大鼠腎組織ASK1免疫組化指標變化（n＝10，±s）

表2 各組大鼠腎組織ASK1免疫組化指標變化（n＝10，±s）

a腎小球評分為非參數資料，用中位數表示；與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別劑量［mg／（kg·d）］腎小球a（評分）腎小管－間質（%）對照－0.5（0～1）2.54±0.63模型－2.5（1～3）**8.48±1.91**TGP給藥502（0～2）＃6.79±1.43＃1001（1～2）＃＃6.44±1.26＃＃2001（0～2）＃＃4.06±0.92＃＃

3 討論

在高血糖或糖尿病腎病時，體內產生的大量活性氧自由基明顯超過機體正常的清除能力，未能清除的活性氧自由基則可激活體內的信號轉導通路或細胞因子，引起腎組織的損傷。為了維持細胞內外氧化還原平衡狀態，細胞本身存在一個調節系統Trx系統，Trx可清除氧自由基對抗氧化應激，Trx還可與細胞內的一種重要的促凋亡蛋白ASK1結合，從而抑制ASK1活性。Txnip也被稱作Trx結合蛋白2（TBP-2）及維生素D3上調蛋白（VDVP-1），高糖是Txnip最主要的生理性刺激物，Txnip通過與ASK1競爭結合Trx，導致了ASK1從Trx-ASK1復合物中釋放出來，游離的ASK1隨后激活下游的c-Jun氨基端激酶（JNK）和絲裂原活化蛋白激酶p38 （p38 MAPK），誘導細胞凋亡，p38 MAPK反過來可促進Txnip表達，加重氧化應激反應，促進糖尿病腎病進展。

研究［5］顯示在糖尿病腎病大鼠造模成功4周時，模型組中Txnip mRNA和蛋白水平均明顯增高，說明在糖尿病腎病的早期已有Txnip的增高。實驗［6］顯示Trx在糖尿病大鼠腎臟組織的表達較正常組明顯減少，而Txnip明顯升高。研究［7］顯示Trx在正常大鼠腎組織中表達較高，在模型組中表達降低。本研究顯示，與對照組比較，模型組腎組織中Txnip表達明顯升高、Trx表達降低，與上述文獻報道一致。Saitoh et al［8］發現Trx可與ASK1的N-末端結合，形成蛋白－蛋白復合物，抑制ASK1活性。本研究提示糖尿病腎組織ASK1表達明顯增加，提示Trx系統與凋亡在糖尿病腎病發病中起重要作用。

白芍系毛莨科植物，有多種生理與藥理活性，研究［9－10］顯示TGP可通過抑制糖尿病大鼠腎組織前炎癥介質的過度表達及減少氧化應激，發揮其保護腎臟的作用并且TGP有不依賴降低血糖、血脂水平的DN保護作用，無明顯毒副作用。但其對于腎組織Trx系統的影響尚不明確，研究［11］表明在高糖環境下抑制p38 MAPK通路能顯著降低Txnip表達，研究［12］顯示TGP可顯著降低糖尿病腎病大鼠腎組織中p38 MAPK的表達，影響p38 MAPK信號通路的激活。本研究表明TGP可使糖尿病大鼠的UAER明顯降低，與模型組比較，TGP給藥組Txnip及ASK1明顯降低，而Trx表達明顯增加，因而，TGP的抗氧化應激作用可能與調節Trx系統有關，TGP可能通過抑制p38 MAPK通路，使Txnip水平降低、Trx水平增加進而降低ASK1水平，發揮其抗氧化應激效應，從而保護糖尿病腎病，并延緩糖尿病腎病進展，但TGP作用于Trx系統的具體機制尚不明確，待進一步研究。

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Effect of total glucosides of paeony on the expression of Txnip，Trx and ASK1 in the kidney from diabetic rats

Wang Zhe，Wu Yonggui，Zhang Chaoqun，et al
（Dept of Nephropathy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo research effect of total glucosides of paeony（TGP）on the expression of thioredoxin-interacting protein（Txnip），thioredoxin（Trx）and apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）investigate role of TGP on thioredoxin system in the kidney from diabetic rats.MethodsDiabetes rats induced with streptozotocin were randomly divided into model group which was treated with TGP［50，100，200 mg／（kg·d），for 8 weeks］；besides，use normal rats as control group.24 h urinary albumin excretion rate（UAER）was determined with ELISA. Txnip，Trx and ASK1 were measured with immunohischemistry，Western blot and real-time PCR.ResultsElevated 24 h UAER was obviously decreased by TGP treatment with 50，100，200 mg／（kg·d）.Compared with diabetic rats，analysis of the immunohischemistry and／or Western blot showed the expression of Txnip and ASK1 was decreased in TGP treatment with 50，100，200 mg／（kg·d）（P＜0.01），and the expression of Trx was increased（P ＜0.01）.Real-time PCR analysis showed that Txnip mRNA expression in diabetic rats was also significantly inhibited by TGP（P＜0.05），and that Trx mRNA was markedly increased by TGP（P＜0.05）.ConclusionThere is an abnormity occuring in the thioredoxin system in the renal tissue of diabetic rats.TGP obviously has the function of renal protection，and its mechanism may be related to the inhibition of Txnip expression and the enhancement of Trx expression.

diabetic nephropathy；thioredoxin；ASK1；total glucosides of paeony

R 587.24

A

1000－1492（2015）07－0916－06

2015－03－10接收

國家自然科學基金（編號：81270813、81374034）；安徽省自然科學基金（編號：1208085MH149）

安徽醫科大學第一附屬醫院腎內科，合肥 230022

王 喆，女，碩士研究生；吳永貴，男，博士生導師，責任作者，E-mail：wuyonggui＠medmail.com.cn