蜂毒素對人肝癌細胞生長的抑制作用及其機制探討

楊瑩瑩，趙 斌，孟曉明，黃 成，李俊

蜂毒素對人肝癌細胞生長的抑制作用及其機制探討

楊瑩瑩，趙 斌，孟曉明，黃 成，李俊

目的研究蜂毒素對人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）生長的抑制作用及其機制。方法采用MTT法檢測蜂毒素對HepG2和SMMC-7721細胞增殖的抑制作用，實時定量PCR檢測細胞中microRNA-203（mir-203）以及PIK3CA mRNA的表達變化，Western blot法檢測磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）的表達變化，瞬時轉(zhuǎn)染人mir-203 mimics過表達mir-203后應(yīng)用實時定量PCR和Western blot檢測mir-203對PI3K／AKT信號通路的作用。結(jié)果與正常組比較，蜂毒素處理組細胞增殖明顯受到抑制，并呈濃度依賴性；實時定量PCR結(jié)果顯示蜂毒素（1、2、4 mg／L）可以明顯升高mir-203的表達，PIK3CA mRNA的表達無明顯改變；Western blot法結(jié)果顯示蜂毒素（1、2、4 mg／L）可以降低PI3K以及P-AKT蛋白的表達。在HepG2和SMMC-7721細胞中過表達mir-203后，與正常組及轉(zhuǎn)染陰性對照組比較，PIK3CA mRNA的表達無明顯改變但PI3K以及P-AKT的蛋白表達降低。結(jié)論蜂毒素能抑制HepG2和SMMC-7721細胞的增殖，其機制可能是通過上調(diào)mir-203的表達，進而在轉(zhuǎn)錄后水平靶向抑制PI3K的表達，抑制PI3K／AKT信號通路的活化。

蜂毒素；人肝癌細胞；增殖抑制；表觀遺傳學；microRNA-203；PI3K／AKT信號通路

蜂毒素是蜂毒的主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗輻射以及強大的抗炎鎮(zhèn)痛作用并可通過不同的細胞死亡機制在不同類型的腫瘤細胞中發(fā)揮細胞毒性［1－2］。IA型磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3Ks）及其下游分子絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）所組成的信號通路在廣泛的人類腫瘤譜中失調(diào)，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、存活與侵襲轉(zhuǎn)移行為［3］。癌癥的發(fā)生也是表觀遺傳學調(diào)控的結(jié)果［4］。異常表達的microRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達與惡性腫瘤的發(fā)病機制相關(guān)［5－6］。目前，蜂毒素對于microRNA表達的影響鮮有研究。該實驗采用蜂毒素體外干預法，觀察蜂毒素對HepG2、SMMC-7721細胞體外增殖的抑制作用并探討其與miR-203及其目標靶基因PI3KCA以及PI3K／AKT信號通路的關(guān)系，為臨床肝細胞癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株（HepG2、SMMC-7721）購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 試劑 蜂毒素（安徽省百春制藥廠）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TRIzol、Lipofectamine 2000 Transfection reagent（美國Invitrogen公司）；ThermoScript RT-PCR synthesis kit（日本TaKaRa公司）；MTT、DMSO（美國Sigma公司）；小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；兔抗PI3K、磷酸化AKT（P-AKT）、AKT（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；RISO RNA Isolation Reagent、EzOmicsTM One-step Qpcr Kit、EzOmicsTM miRNA Qpcr Detection Primer Set（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；QuantiFast SYBR Green PCR Kit（德國QIAGEN公司）；人mir-203 mimics、陰性對照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；實時定量PCR引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 實驗器材 MK3型酶標儀（荷蘭雷勃公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；NAPC0-6100型細胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）；PCR擴增儀（德國Eppedorf公司）；Bio-rad電泳儀（美國伯樂公司）；熒光定量PCR檢測儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 方法

1.2.1 HepG2、SMMC-7721細胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%密度時進行傳代。

1.2.2 細胞增殖實驗

1.2.2.1 實驗分組 正常組：作為各處理組的共同對照；蜂毒素處理組：設(shè)1、2、4 mg／L濃度組，每組5個復孔，重復實驗3次。

1.2.2.2 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的SMMC-7721 和HepG2細胞制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后加入不同濃度的蜂毒素，作用48 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg／ml），在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，每孔加入150 μl的DMSO溶解結(jié)晶，室溫振蕩待結(jié)晶完全溶解后，于490 nm波長測吸光度（absorbance，A）值。

1.2.3 實時定量PCR檢測SMMC-7721和HepG2細胞中mir-203與PIK3CA mRNA的表達 應(yīng)用RISO RNA Isolation Reagent提取SMMC-7721和HepG2細胞的總RNA，應(yīng)用EzOmics miRNA Qpcr Detection Primer Set和EzOmicsTMOne-step Qpcr Kit 在PiKo Real的96孔實時定量PCR檢測系統(tǒng)中檢測mir-203的表達，每組設(shè)2個復孔。PCR的擴增條件：37℃、60 min用于反轉(zhuǎn)錄；95℃、10 min用于熱失活變性；95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s，重復35個循環(huán)用于擴增。miR-203的相對表達量以U6為內(nèi)參應(yīng)用標準的2－ΔΔCt法進行計算。

應(yīng)用TRIzol提取SMMC-7721和HepG2細胞的總RNA，根據(jù)說明書上的步驟采用ThermoScript RTPCR synthesis kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。應(yīng)用QuantiFast SYBR Green RT-PCR kits在PiKo Real 的96孔實時定量PCR檢測系統(tǒng)中檢測PIK3CA mRNA的表達，每組設(shè)2個復孔，擴增條件為：95℃、5 min，60℃、30 s，72℃、30 s重復40個循環(huán)，72℃、30 s。以β-actin基因作為內(nèi)參，應(yīng)用2－ΔΔCt法計算PIK3CA mRNA的相對表達量。PIK3CA和β-actin的引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物

1.2.4 Western blot法檢測PI3K、P-AKT、AKT蛋白的表達 取經(jīng)蜂毒素處理24 h后細胞，經(jīng)PBS清洗后每瓶細胞加入含1%PMSF的RIPA細胞裂解液400 μl，于冰上裂解30 min后轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中，4℃、12 000 r／min離心15 min后取上清液至新的1.5 ml EP管中，用BCA法進行蛋白定量后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃、10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后應(yīng)用電轉(zhuǎn)移法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。室溫下用5%的脫脂奶粉將PVDF膜封閉3 h，用TBST緩沖液清洗后在一抗中孵育4℃過夜，一抗的稀釋濃度為：PI3K（1∶300）、P-AKT（1∶500）、AKT（1∶500）、β-actin（1∶800）。孵育后的PVDF膜經(jīng)TBST清洗后在辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000稀釋）中室溫孵育2 h，再經(jīng)TBST清洗后采用ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，以各蛋白與βactin的光密度比值表示蛋白的相對表達量。

1.2.5 mic-203 mimics轉(zhuǎn)染實驗

1.2.5.1 實驗分組 正常組、轉(zhuǎn)染mir-203 mimics組、轉(zhuǎn)染陰性對照組。

1.2.5.2 脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染實驗 在轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期SMMC-7721和HepG2細胞接種于無血清的DMEM中待細胞密度達到60%～80%時應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染中各試劑用量參照Lipofectamine 2000手冊。轉(zhuǎn)染后6 h后將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24 h提取細胞總RNA，轉(zhuǎn)染后48 h提取細胞總蛋白進行檢測。根據(jù)BlocK-iT Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo protocol確定陽離子脂質(zhì)體法的轉(zhuǎn)染效率。mir-203 mimics及陰性對照的寡核苷酸序列見表2。

表2 RNA引物序列

1.2.6 預測mir-203的靶基因 應(yīng)用TargetScan-Human（Release 6.2，http：／／www.targetscan.org）來預測mir-203潛在的靶點（圖1）。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 蜂毒素對SMMC-7721和HepG2細胞增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示，與正常組比較，蜂毒素各濃度處理組（1、2、4 mg／L）對SMMC-7721和HepG2細胞增殖均有明顯的抑制作用（F＝152.892、451.196），且隨藥物濃度的增加，抑制作用增強，HepG2細胞在低中濃度（1、2 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在高濃度（4 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SMMC-7721細胞在低濃度（1 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在中高濃度（2、4 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），具有濃度依賴性。見圖2。

2.2 蜂毒素對SMMC-7721和HepG2細胞中mir-203表達的影響SMMC-7721和HepG2細胞經(jīng)不同濃度蜂毒素（1、2、4 mg／L）處理24 h后，mir-203的表達升高（F＝65.64、68.20），且隨給藥濃度的增加表達水平升高。HepG2細胞在低中濃度（1、2 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在高濃度（4 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SMMC-7721細胞在低濃度（1 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在中高濃度（2、4 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），具有濃度依賴性。見圖3。

2.3 蜂毒素對SMMC-7721和HepG2細胞中PIK3CA mRNA表達的影響經(jīng)不同濃度蜂毒素（1、2、4 mg／L）處理24 h后，PIK3CA mRNA的表達在SMMC-7721和HepG2中均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（F＝0.198、0.676，P＞0.05），見圖4。

2.4 蜂毒素對SMMC-7721和HepG2細胞中PI3K、P-AKT、AKT蛋白表達的影響經(jīng)不同濃度蜂毒素（1、2、4 mg／L）處理24 h后，PI3K和P-AKT蛋白的表達在HepG2細胞中下降（F＝59.834、48.105），在SMMC-7721細胞中（F＝63.678、73.588），且隨著給藥濃度的增加蛋白表達水平逐漸降低，低濃度（1 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中高濃度（2、4 mg／L）時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），具有濃度依賴性。見圖5。

2.5 mir-203對SMMC-7721和HepG2細胞中PI3K／AKT信號通路的影響與正常組比較，在SMMC-7721和HepG2細胞中轉(zhuǎn)染mir-203 mimics均能明顯升高mir-203的表達，差異有統(tǒng)計學意義（F＝168.823、606.077，P＜0.01）。而轉(zhuǎn)染陰性對照組mir-203的表達無明顯改變。見圖6。與正常組比較，轉(zhuǎn)染mir-203 mimics組和轉(zhuǎn)染陰性對照組中PIK3CA mRNA的表達在SMMC-7721細胞和HepG2細胞中均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（F＝2.018、0.002），見圖7；轉(zhuǎn)染mir-203 mimics組中PI3K的蛋白表達明顯降低（F＝149.671、48.627，P ＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；P-AKT的蛋白水平也明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝244.554、146.534，P＜0.01）。在轉(zhuǎn)染陰性對照組中未見明顯改變。見圖8。

3 討論

原發(fā)性肝細胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。死亡率高，在惡性腫瘤的死亡率中居于前三并且在世界范圍內(nèi)缺乏有效的治療手段，僅有小部分患者符合外科手術(shù)治療的條件并且多數(shù)患者術(shù)后的五年存活率較低［7］。原發(fā)性肝細胞癌的快速復發(fā)和頻繁的遠端轉(zhuǎn)移是其不良預后的主要原因。原發(fā)性肝細胞癌嚴重的不良預后使得深入研究致瘤信號通路的活化機制以及癌癥相關(guān)基因的調(diào)控機制并針對性的研究和開發(fā)相應(yīng)的抗腫瘤藥物顯得愈發(fā)重要。

microRNA是一類小型非編碼RNA，已知其能通過與目標靶基因的3’非編碼區(qū)形成完全或不完全互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達［8］。研究［9］表明絕大多數(shù)的microRNA能夠參與調(diào)控腫瘤細胞的多種生物學過程，例如細胞的增殖、凋亡和侵襲等。研究［10－15］報道m(xù)ir-203在包括肝癌細胞在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞中表達明顯降低，并且低表達的mir-203參與調(diào)控多種致瘤性信號通路的活化。

蜂毒素是蜂毒的主要活性成分，具有高度的藥理作用和生物學活性，其抗惡性腫瘤的作用已在多種惡性腫瘤細胞中得到證實，而其對肝細胞癌的增殖的抑制作用鮮有報道且具體的機制不明。本研究顯示蜂毒素對兩種人肝癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用且隨藥物濃度的升高抑制作用逐漸增強。其中SMMC-7721對于蜂毒素的敏感性更強，其增殖在給藥濃度為2 mg／L時即受到明顯抑制，而HepG2細胞的增殖在給藥濃度為4 mg／L時受到明顯抑制。在進一步探討其具體機制時，本研究顯示SMMC-7721和HepG2細胞在不同濃度的蜂毒素處理后，mir-203的表達在兩種肝癌細胞中均明顯升高且具有濃度依賴性。應(yīng)用生物信息學軟件預測mir-203可能的靶基因時顯示PIK3CA是mir-203潛在的靶基因。PIK3CA是新近發(fā)現(xiàn)的一種體細胞突變的癌基因，編碼I類PI3Ks的催化亞單位并可通過增強PI3Ks的活化通過PI3K／AKT信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖。本實驗結(jié)果顯示不同濃度蜂毒素體外刺激SMMC-7721和HepG2細胞后PIK3CA的mRNA表達無明顯改變，但PI3K蛋白表達水平明顯降低且呈濃度依賴性，同時顯示P-AKT的蛋白水平也明顯降低且具有濃度依賴性，提示給予蜂毒素處理后PIK3CA基因的表達在轉(zhuǎn)錄后水平被抑制并且能夠抑制PI3K／AKT信號通路的活化。

SMMC-7721和HepG2細胞中轉(zhuǎn)染mir-203 mimics顯示過表達mir-203后，PIK3CA的mRNA水平無明顯改變，但PI3K的蛋白表達明顯降低并且P-AKT的蛋白水平也隨之降低，提示升高mir-203能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PIK3CA基因的表達并抑制PI3K／AKT信號通路的活化。同時顯示給予兩種肝癌細胞相同濃度的轉(zhuǎn)染試劑mir-203 mimics處理后，SMMC-7721細胞中mir-203升高的倍數(shù)更高，轉(zhuǎn)染效率更好。

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Inhibitory effect of melittin on growth of human hepatocellular carcinoma cells

Yang Yingying，Zhao Bin，Meng Xiaoming，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University；Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University；Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and its mechanisms of melittin on the growth of human hepatocellular carcinoma cells（HepG2，SMMC-7721）.MethodsThe inhibition rate of growth of cells treated with melittin was measured using MTT assay.Relative levels of microRNA-203（mir-203）and PIK3CA mRNA in HepG2 and SMMC-7721 cells were determined with a SYBR Green using quantitative real-time PCR detection system.The relative protein expressions of PI3K，P-AKT and AKT were observed by Western blot.miR-203 mimics was transfected into HepG2 and SMMC-7721 cells to enhance miR-203 expression.The effect of up-regulation of miR-203 on PI3K／AKT signaling pathway of HepG2 and SMMC-7721 cells was evaluated using Western blot and quantitative real-time PCR.ResultsCompared with the control group，melittin had obvious inhibitory effect on the growth of human hepatocellular carcinoma cells in a dose-and-time dependent manner.After the treatment with melittin at different concentrations for 24 h，the results showed that melittin（1，2，4 mg／L）could up-regulate the expression of mir-203.Relative levels of PIK3CA mRNA had not noticeably altered but the relative protein expressions of PI3K and P-AKT were obviously increased.Over-expression of mir-203 significantly inhibited the expression of PI3K and P-AKT in the protein level.ConclusionProliferation activity of HepG2，SMMC-7721 cells is inhibited by melittin which may be related to the up-regulation of mir-203，which inhibited the expression of PI3K in the protein level and the inhibitory effect on PI3K／AKT signaling transduction.

melittin；human hepatocellular carcinoma cells；proliferation inhibition；epigenetics；microRNA-203；PI3K／AKT signaling pathway

R 962.1

A

1000－1492（2015）07－0982－06

2015－03－24接收

國家自然科學基金（編號：81273526）

安徽醫(yī)科大學藥學院、安徽醫(yī)科大學肝病研究所、安徽省高校產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究院，合肥 230032

楊瑩瑩，女，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj ＠ahmu.edu.cn