α-硫辛酸對H9c2心肌細胞低氧及低氧／復氧損傷的保護作用及其機制探討

操全霞，丁旵東

α-硫辛酸對H9c2心肌細胞低氧及低氧／復氧損傷的保護作用及其機制探討

操全霞，丁旵東

目的探討α-硫辛酸（α-LA）對H9c2心肌細胞低氧及低氧／復氧損傷的保護作用及其作用機制。方法研究包括H9c2心肌細胞低氧實驗和低氧／復氧實驗兩部分，分成常氧組、低氧組或低氧／復氧組、LA組、乙醛脫氫酶抑制劑異黃酮苷（Daidzin）組（Daidzin組）、二甲亞砜（DMSO）溶劑對照組（DMSO組）。采用噻唑藍（MTT）比色法檢測心肌細胞存活率；微量酶標法測定乳酸脫氫酶（LDH）活性；ELISA法檢測心肌細胞乙醛脫氫酶2（ALDH2）活性；硫代苯巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）水平。結果與常氧組比較，低氧組及低氧／復氧組細胞存活率均下降（P＜0.01），LDH活性及MDA含量均升高（P＜0.01）；與低氧組或低氧／復氧組比較，LA組細胞存活率上升（P＜0.01）、ALDH2活性增加（P＜0.05）、LDH活性及MDA含量降低（P＜0.01）；LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較，LA組與DMSO組間存活率、ALDH2、LDH、MDA比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；Daidzin組與LA組、DMSO組比較，細胞存活率及ALDH2活性降低（P＜0.05），LDH活性及MDA含量升高（P＜0.05），差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論α-LA可通過上調ALDH2活性并減少過氧化終產物形成，最終減輕心肌細胞低氧及低氧／復氧過程中的氧化損傷。

α-硫辛酸；異黃酮苷；乙醛脫氫酶；心肌細胞；低氧；低氧／復氧

隨著生活水平的提高，冠心病日漸成為威脅人類生命健康的主要疾病。冠狀動脈粥樣硬化引起血管管腔狹窄或阻塞是冠心病發生發展的主要機制，經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）或冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG）開通嚴重病變的冠狀動脈，進行血運重建，極大地緩解了冠心病心肌缺血癥狀及預后。但不適用于PCI或CABG手術的冠狀動脈分支病變所致的心肌缺血，以及“罪犯”血管開通后導致的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）［1］，仍然是困擾臨床工作者的現實問題，如何進一步減少心肌缺血或IRI是目前臨床研究關注的熱點。研究［2－5］表明，自由基損傷在缺血及IRI的發病機制中起著關鍵性作用。Trevisan et al［6］研究心血管病危險因素時發現，心血管危險因子數量與氧化應激狀態及抗氧化能力降低呈顯著相關性。研究［7－8］顯示，乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）能降低大鼠心肌低氧損傷引起的細胞凋亡及心肌IRI時氧化應激水平，改善其心臟功能，而且對氧化應激導致的神經細胞、內皮細胞損傷有拮抗作用。α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，α-LA）作為ALDH2的激活劑及較強的抗氧化劑，是否對心肌缺血或IRI起到保護作用尚不清楚。該實驗通過H9c2心肌細胞低氧和低氧／復氧模型，研究α-LA是否對H9c2心肌細胞低氧或低氧／復氧損傷起到保護作用并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株H9c2大鼠心肌細胞株購自上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 主要試劑和儀器α-LA（山西亞寶藥業集團股份有限公司）；異黃酮苷（Daidzin）（上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM合成培養基（美國Hyclone公司）；噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALDH2試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（杭州碧云天生物技術有限公司）；其余試劑為國產分析純級；CO2培養箱（美國Thermo公司）；低氧小室（美國billups rothenberg inc公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。Daidzin溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。

1.3 低氧及低氧／復氧損傷模型的建立［9］低氧模型建立：H9c2心肌細胞正常培養24 h達60%～70%融合后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養并置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內37℃培養24 h。低氧／復氧模型建立：H9c2心肌細胞正常培養24 h達60%～70%后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養并置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內37℃培養24 h后，置于37℃、5% CO2的普通培養箱復氧12 h。

1.4 實驗步驟

1.4.1 H9c2心肌細胞的培養 H9c2細胞株在含10%胎牛血清高糖DMEM完全培養基中培養（條件為37℃、5%CO2），2～3 d傳代1次，實驗時取對數生長期細胞。

1.4.2 實驗分組及設計 低氧模型分組：常氧組（正常培養24 h后換液，不做任何處理繼續培養24 h）；低氧組（正常培養24 h后換成不含血清的高糖DMEM培養基培養并置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h）；LA組（正常培養24 h后換成不含血清的高糖DMEM培養基培養及1×10－4mol／L［9］的α-LA，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h）；Daidzin組（正常培養24 h后換成不含血清的高糖DMEM培養基培養、1×10－4mol／L的α-LA及60 μmol／L Daidzin［10］，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h）；DMSO組（正常培養24 h后換成不含血清的高糖DMEM培養基培養、1×10－4mol／L的α-LA及DMSO，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h）。

低氧／復氧模型分組：常氧組（正常培養24 h后換液，繼續培養36 h，不做任何處理）；低氧／復氧組（正常培養24 h后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養并置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h，置于37℃、5%CO2的普通培養箱復氧12 h）；LA組（正常培養24 h后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養及1×10－4mol／L的α-LA，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培養箱復氧12 h）；Daidzin組（正常培養24 h后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養、1×10－4mol／L的α-LA及60 μmol／L Daidzin，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培養箱復氧12 h）；DMSO組（正常培養24 h后，換成不含血清的高糖DMEM培養基培養、1×10－4mol／L 的α-LA及DMSO，置于充滿95%N2、5%CO2的低氧小室內培養24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培養箱復氧12 h）。

1.5 H9c2心肌細胞存活率測定采用MTT［11］比色法檢測（設不加細胞只加孵育液為空白組）。培養96孔板中的H9c2心肌細胞，接種密度為8 500個／孔，各組進行相應處理后，每孔加入MTT溶液（5 mg／ml）10 μl，37℃孵育4 h后移棄培養液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度（absorbance，A）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（A試驗組／A對照組）×100%。

1.6 LDH活性檢測各組進行相應處理后，吸取細胞培養上清液，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.7 MDA含量檢測各組進行相應處理后，吸取細胞裂解上清液，采用硫代巴比妥酸法測定MDA，按照試劑盒說明進行檢測。

1.8 ALDH2活性檢測各組進行相應處理后，吸取細胞裂解上清液，采用ELISA法測定ALDH2活性，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.9 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，所有資料呈正態分布，所有實驗重復6次，數據以ˉx ±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 α-LA對心肌細胞存活率的影響

2.1.1 低氧模型 低氧組與常氧組比較心肌細胞存活率顯著下降（P＜0.01），LA組與低氧組比較心肌細胞存活率顯著上升（P＜0.01），表明α-LA能顯著改善心肌細胞活力。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝14.514，P＜0.01）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P ＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA改善細胞活力的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表1。

2.1.2 低氧／復氧模型 低氧／復氧組與常氧組比較心肌細胞存活率顯著下降（P＜0.01），LA組與低氧／復氧組比較心肌細胞存活率顯著上升（P＜0.01），表明α-LA能顯著改善心肌細胞活力。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝5.271，P＜0.05）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA改善細胞活力的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表2。

2.2 α-LA對心肌細胞LDH的影響

2.2.1 低氧模型 低氧組與常氧組比較心肌細胞培養上清的LDH活力升高（P＜0.01），LA組與低氧組比較心肌細胞培養上清的LDH活力顯著降低（P＜0.01），表明α-LA能顯著降低低氧組的LDH釋放率。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝18.674，P＜0.01）；兩兩比較顯示Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA減少LDH釋放的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表1。

2.2.2 低氧／復氧模型 低氧／復氧組與常氧組比較心肌細胞培養上清的LDH活力升高（P＜0.01），LA組與低氧／復氧組比較心肌細胞培養上清的LDH活力顯著降低（P＜0.01），表明α-LA能顯著降低低氧／復氧組的LDH釋放率。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝17.684，P＜0.01）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA減少LDH釋放的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表2。

2.3 α-LA對心肌細胞MDA的影響

2.3.1 低氧模型 低氧組與常氧組比較心肌細胞的MDA含量升高（P＜0.01），LA組與低氧組比較心肌細胞的MDA含量顯著降低（P＜0.01），表明α-LA能顯著降低低氧組的MDA含量。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝7.757，P＜0.05）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA減少MDA含量的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表1。

2.3.2 低氧／復氧模型 低氧／復氧組與常氧組比較MDA含量升高（P＜0.01），LA組與低氧／復氧組比較心肌細胞的MDA含量顯著降低（P＜0.01），表明α-LA能顯著降低低氧／復氧組的MDA含量。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較比較差異有統計學意義（F＝23.124，P＜0.01）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA減少MDA含量的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表2。

2.4 α-LA對心肌細胞ALDH2的影響

2.4.1 低氧模型 低氧組與常氧組比較ALDH2含量無顯著差異（P＞0.05），LA組與低氧組比較ALDH2含量上升（P＜0.05），表明α-LA能顯著增加心肌細胞ALDH2的含量。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較比較差異有統計學意義（F＝16.376，P ＜0.01）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P ＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA增加ALDH2含量的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表1。

2.4.2 低氧／復氧模型 常氧組與低氧／復氧組比較心肌細胞的ALDH2含量無顯著差異（P＞0.05），LA組與低氧／復氧組比較ALDH2含量上升（P＜0.05），表明α-LA能顯著增加心肌細胞ALDH2的含量。LA組、Daidzin組、DMSO組3組比較差異有統計學意義（F＝9.231，P＜0.05）；兩兩比較顯示，Daidzin組與LA組、Daidzin組與DMSO組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），LA組與DMSO組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA增加ALDH2含量的作用，DMSO對α-LA的作用無影響，見表2。

表1 α-LA對低氧損傷后H9c2心肌細胞的影響（n＝6，±s）

表1 α-LA對低氧損傷后H9c2心肌細胞的影響（n＝6，±s）

與低氧組比較：*P＜0.05；與LA組比較：＃P＜0.05

項目常氧組低氧組LA組Daidzin組DMSO組心肌細胞存活率（%）100.00±00.00*66.73±2.0683.75±2.48*74.53±3.64＃79.01±5.89 LDH活性（U／L）101.12±21.62*221.78±29.67148.04±29.35*230.78±29.41＃154.04±18.38心肌細胞MDA含量（nmol／ml）0.555±0.054*1.265±0.0760.766±0.097*1.121±0.146＃0.824±0.107心肌細胞ALDH2含量（ng／ml）0.300±0.0670.229±0.0540.394±0.014*0.305±0.043＃0.390±0.125

表2 α-LA對低氧／復氧損傷后H9c2心肌細胞的影響（n＝6，±s）

表2 α-LA對低氧／復氧損傷后H9c2心肌細胞的影響（n＝6，±s）

與低氧／復氧組比較：*P＜0.05；與LA組比較：＃P＜0.05

項目常氧組低氧／復氧組LA組Daidzin組DMSO組心肌細胞存活率（%）100.00±00.00*51.75±6.7966.59±5.75*54.91±8.61＃65.04±4.82 LDH活性（U／L）131.14±21.40*261.66±30.11199.28±21.49*274.52±25.72＃206.57±24.7心肌細胞MDA含量（nmol／ml）0.637±0.058*1.629±0.0621.046±0.069*1.477±0.106＃1.141±0.063心肌細胞ALDH2含量（ng／ml）0.317±0.1240.303±0.0380.400±0.039*0.283±0.047＃0.383±0.011

3 討論

冠心病的發生與冠狀動脈粥樣硬化的程度有密切關系，藥物治療可延緩或阻止冠狀動脈粥樣硬化病變的發展，改善心肌供血，減少心絞痛的發作及心肌梗死的發生，但對于冠狀動脈嚴重狹窄甚至閉塞病變，PCI或CABG在血運重建方面則起著更為重要的作用，當然可能由此導致的心肌IRI仍然備受關注。心肌IRI是指心肌血供中斷一段時間后又突然恢復了血供，原缺血心肌發生了較血供恢復前更嚴重的損傷［12］，心肌再灌注時產生的大量氧自由基是導致心肌再灌注損傷的主要因素［13］。MDA作為脂質過氧化的代謝產物其含量可以反映細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度，LDH的活性也是評價心肌細胞低氧及低氧復氧損傷程度的重要指標，MTT是一種可以進入活細胞的染料，吸光度值反映出心肌細胞內線粒體脫氫酶的活性，同時還間接反映心肌細胞的存活情況。本實驗低氧組及低氧／復氧組與常氧組比較，心肌細胞存活率降低，培養液中LDH活性升高，心肌細胞MDA含量升高，表明本實驗中心肌細胞低氧損傷模型和低氧／復氧模型建立是成功的，為分析ALDH2激活劑α-LA的保護作用和ALDH2特異性抑制劑Daidzin的干預作用提供了可靠的基礎。

α-LA作為ALDH2的激活劑，同時也是一種較強的抗氧化劑，能否在抗低氧或低氧／復氧損傷方面發揮重要作用值得進一步探討。本研究顯示，與低氧組或低氧／復氧組比較，α-LA能使低氧或低氧／復氧心肌細胞的ALDH2活性顯著增加，LDH、MDA含量顯著下降，從而顯著提高了低氧或低氧／復氧條件下的細胞存活率，加入ALDH2特異性抑制劑Daidzin后可顯著抑制α-LA的這一作用，差異均有統計學意義。為排除Daidzin的溶媒DMSO對實驗結果的影響，增設DMSO組對照，顯示DMSO組數據與LA組比較差異無統計學意義，說明加入Daidzin后對α-LA保護作用的抑制系Daidzin對ALDH2特異性抑制所致。

綜上所述，α-LA可以通過上調ALDH2的活性、減少過氧化終產物的形成，實現減輕心肌細胞低氧損傷和低氧／復氧損傷的目的，為臨床應用α-LA治療冠心病缺血損傷和再灌注損傷提供理論依據。

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The protective effects of alpha-lipoic on H9c2 cardiomyocytes undergoing hypoxia or hypoxia／reoxygenation（H／R）injury and its possible mechanism

Cao Quanxia，Ding Chandong
（Dept of Internal Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the protective effects of alpha-lipoic（α-LA）on H9c2 cardiomyocytes undergoing hypoxia or hypoxia／reoxygenation（H／R）injury and explore its possible mechanisms.MethodsH9c2 cardiomyocytes in hypoxia or H／R injury researches were respectively divided into normal control group，hypoxia or H／R group，hypoxia or H／R＋α-LA group（LA group），hypoxia or H／R＋α-LA＋Daidzin group（Daidzin group）and hypoxia or H／R＋α-LA＋DMSO group（DMSO group）.The myocardial cell survival was detected by MTT，the activity of LDH and ALDH2 were respectively analyzed by microtitration and ELISA，the MDA level was measured by TBA.ResultsCompared to the normal control group，the cell survival rates of hypoxia and H／R group were decreased（P＜0.01），the levels of MDA and LDH were significantly increased（P＜0.01）.Compared to the hypoxia or H／R group，the cell survival rates and ALDH2 activities of LA group were improved（P＜0.05），the levels of MDA and LDH were decreased（P＜0.01）.Compared to the LA group and DMSO group，the cell survival rates and ALDH2 activities of Daidzin group were decreased（P＜0.05），the levels of MDA and LDH were increased（P＜0.05），and no significant differences of all the above measures were found between LA group and DMSO group（P＞0.05）.Conclusionα-LA can protect H9c2 cardiomyocytes from hypoxia or H／R injury by means of upregulating activities of ALDH2 and decreasing hypoxia or H／R induced lipid peroxidation.

alpha-lipoic acid；Daidzin；ALDH2；cardiomyocyte；hypoxia；hypoxia／reoxygenation

R 541.4

A

1000－1492（2015）07－1024－05

2015－03－17接收

安徽省衛生廳醫學科研課題計劃（編號：2010C058）

安徽醫科大學第二附屬醫院綜合內科，合肥 230601

操全霞，女，碩士研究生；丁旵東，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：dcdsunshine＠sina.com