細針穿刺細胞學聯合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結節診斷中的價值

張博茗，林元強，隋國慶，王 洋，趙倩倩，王 輝

吉林大學中日聯誼醫院超聲科，吉林 長春 130033

細針穿刺細胞學聯合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結節診斷中的價值

張博茗，林元強，隋國慶，王 洋，趙倩倩，王 輝

吉林大學中日聯誼醫院超聲科，吉林 長春 130033

王輝，主任醫師，教授，吉林大學博士研究生導師。現任吉林大學中日聯誼醫院超聲科主任，中華醫學會超聲醫學分會委員，中國超聲醫學工程學會常務理事，吉林省超聲醫學工程學會會長，吉林省醫學會超聲醫學分會主任委員。主要從事腹部超聲、超聲造影及介入超聲診斷與治療的臨床工作及研究。2012年被中國超聲醫學工程學會授予優秀超聲醫學專家獎。擔任《中華超聲影像學志》、《中國醫學影像技術雜志》、《中國臨床醫學影像雜志》、《中國實驗診斷學雜志》、《中國老年醫學雜志》和《吉林醫學雜志》編委。先后主持省部級科研項目3項，獲省教育廳教學成果一等獎1項、三等獎3項，獲吉林大學醫療成果二等獎3項、三等獎5項。至今已發表學術論文100余篇，其中SCI收錄論文8篇。

目的：研究細針穿刺細胞學(fine-needle aspiration cytology，FNAC)聯合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結節診斷中的應用價值。方法：收集2014年6月—2015年6月因甲狀腺結節至吉林大學中日聯誼醫院就診且經超聲檢查可疑惡性的患者87例，均行超聲引導下FNAC檢查和穿刺標本BRAFV600E突變熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測。結果：術后病理診斷為惡性的64例患者中，術前FNAC陽性48例、陰性16例；BRAFV600E突變40例。術后病理診斷為良性的23例患者中，術前FNAC陽性5例、陰性18例；BRAFV600E突變0例。與術后病理結果對照，FNAC對甲狀腺癌診斷的靈敏度為75.0%、特異度為78.3%、準確率為75.9%；BRAFV600E突變檢測的靈敏度為62.5%、特異度為100%、準確率為72.4%；FNAC聯合BRAFV600E突變檢測的靈敏度為89.1%、特異度為78.3%、準確率為86.2%。結論：FNAC聯合BRAFV600E基因突變檢測可提高甲狀腺惡性結節診斷的靈敏度。

甲狀腺結節；細針穿刺細胞學；BRAF基因突變檢測

【Key words】 Thyroid nodule; Fine-needle aspiration cytology; BRAF mutation detection

甲 狀 腺 乳 頭 狀 癌 (papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌中最多見的類型，占甲狀腺癌的80%～90%[1-2]。目前，甲狀腺細針穿刺細胞學檢查(fine-needle aspiration cytology，FNAC)以其微創、易行、準確率高的特點，成為臨床上診斷甲狀腺結節良惡性最常用的方法。但由于細針穿刺所獲標本量有限，不能反映病變的全貌，且診斷依賴操作醫師及病理醫師的經驗，文獻報道假陰性率在20%左右[3]。因此，尋求一種能提高FNAC對甲狀腺惡性結節診斷率的方法勢在必行。

BRAF基因位于人染色體7q34，編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶。其突變大多位于第1 799位點腺嘌呤替代了胸腺嘧啶，導致激酶活性片段第600位谷氨酸取代了纈氨酸，從而持續激活BRAF激酶，引起持續的絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase，MEK)磷酸化和下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路反應，導致腫瘤形成。在多數文獻報道中，BRAFV600E突變與腫瘤的發生、分化及侵襲性有關，常見于PTC，且是后者最常見的遺傳學事件。但BRAFV600E在甲狀腺惡性結節中突變率低，尚不能滿足臨床診斷需求。如果部分FNAC未能檢測出明確診斷的惡性結節中存在BRAFV600E突變，而突變能通過細針穿刺標本檢出，那么理論上兩者相結合用于診斷甲狀腺惡性結節應較單獨FNAC更具有臨床意義。因此，本研究探討FNAC聯合BRAFV600E突變檢測在甲狀腺結節定性診斷方面的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究中87份樣本來自2014年6月—2015年6月至吉林大學中日聯誼醫院就診的經超聲檢查認為具有可疑惡性特征的甲狀腺結節患者。其中男性28例、女性59例；年齡27～72歲，平均年齡(41.7±9.6)歲。結節大小1.0～2.5 cm。超聲表現為實性低回聲的結節87個，形態不規則的結節51個，縱橫比＞1的結節33個，內可見微鈣化或砂礫樣鈣化的結節37個，血流豐富的結節15個，伴頸部淋巴結形態異常的結節19個。

1.2 穿刺方法

患者排除FNAC禁忌證，術前簽署知情同意書。取仰臥位，肩部墊高15°～30°，保持頭頸部過伸位。超聲下定位穿刺點，皮膚消毒，鋪無菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用TSK一次性負壓吸引穿刺針(21G)，超聲引導下沿預定針道進入結節中心，負壓狀態下多點抽吸≥5次，標本涂片3～4張，95%乙醇固定(圖1)。

圖1 超聲引導下FNAC

1.3 細胞學診斷方法

按照甲狀腺細胞病理學Bethesda分類標準：① 標本不滿意或不能診斷；② 良性；③ 不能明確意義的不典型病變或濾泡性病變；④ 濾泡性新生物；⑤ 可疑惡性；⑥ 惡性。本研究將⑤、⑥ 統一歸類為細胞學陽性，將①～④歸類為細胞學陰性(圖2)。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌FNAC涂片

1.4 BRAF基因突變檢測

根據組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取DNA。用BRAFV600E突變檢測試劑盒(武漢友芝友醫療科技有限公司)將DNA樣本與聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)緩沖液、引物探針等制成反應液，利用熒光定量PCR儀對熒光信號強度進行檢測，計算ΔCt值(ΔCt值=突變檢測Ct值-質控檢測Ct值)，結果定性分析(圖3)。

圖3 BRAFV600E突變樣本檢測圖

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 手術病理結果

87例甲狀腺結節患者全部經手術切除。術后病理為：惡性64例中，乳頭狀癌63例、濾泡狀癌1例；良性23例全部為結節性甲狀腺腫，其中5例伴局部濾泡上皮異型增生。

2.2 FNAC與術后病理對照

與術后病理對照，術前FNAC診斷甲狀腺癌的靈敏度為75.0%(48/64)，特異度為78.3% (18/23)，準確率為75.9%(66/87)。詳見表1。

2.3 BRAFV600E突變檢測與術后病理對照

術后病理診斷為惡性的64例患者中，術前檢測到BRAFV600E突變40例；術后病理診斷為良性的23例患者中，術前未檢測到BRAFV600E突變。且術前檢測出BRAFV600E突變的40例患者術后病理均證實為乳頭狀癌。

與術后病理對照，BRAFV600E突變檢測診斷甲狀腺癌的靈敏度為62.5%(40/64)，特異度為100%(23/23)，準確率為72.4%(63/87)。詳見表2。

表1 術前FNAC與術后病理結果對照

表2 術前BRAFV600E檢測與術后病理結果對照

2.4 FNAC聯合BRAFV600E突變檢測與術后病理對照

FNAC聯合BRAFV600E突變檢測診斷甲狀腺癌的靈敏度為89.1%(57/64)，特異度為78.3% (18/23)，準確率為86.2%(75/87)。均高于單獨BRAFV600E突變檢測，差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表3。FNAC聯合BRAFV600E突變檢測的靈敏度高于單獨FNAC，差異有統計學意義(P＜0.05)，兩者特異度比較差異無統計學意義(P＞0.05)，準確率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表4。而FNAC與BRAFV600E突變均為陽性的31例患者術后病理全部為惡性。

表3 術前FNAC聯合BRAFV600E突變檢測與術后病理結果對照

表4 術前FNAC、BRAFV600E突變檢測與兩者聯合的診斷率比較

3 討 論

超聲引導下甲狀腺結節FNAC檢查作為臨床最常用的甲狀腺結節良惡性鑒別方法，具有快捷、準確率高的優勢。對于有經驗的醫師，FNAC的靈敏度波動于65%～98%，平均值約為83%，特異度波動于72%～100%[4]。但其仍有一定局限性：如病理呈不典型表現，無乳頭狀結構或細胞核僅輕微改變，造成乳頭狀癌的假陰性；由于細針穿刺所獲標本量有限，且標本中的組織形態和細胞間質結構大部分或完全破壞，不能反映腫瘤外血管或包膜的侵犯程度，無法鑒別濾泡狀腺瘤與濾泡狀癌；或者結節內部血流豐富，過多紅細胞污染涂片；另外，操作醫師及病理醫師的經驗也對FNAC結果有較大影響。本研究顯示，單獨FNAC的靈敏度為75.0%，16例乳頭狀癌患者被診斷為良性，因穿刺過程中未取得結節中惡性病變部位所致；FNAC的特異度為78.3%，5例假陽性患者細胞病理發現異型性或乳頭狀增生，診斷為乳頭狀癌或傾向于乳頭狀癌，但術后病理未達到診斷標準。因此，FNAC診斷甲狀腺結節的正確率尚不能完全滿意。

BRAFV600E突變與乳頭狀癌的發生有著密切關系，文獻報道29%～83%的乳頭狀癌可檢測出BRAFV600E突變[5-7]，而良性病變則不表達。本研究術前發現BRAFV600E突變的40例患者經術后病理證實均為乳頭狀癌，且良性病變23例均未發現BRAFV600E突變，表明BRAFV600E突變是與良性病變無關的遺傳學事件。盡管BRAFV600E突變診斷乳頭狀癌的特異度為100%，但其突變率低導致靈敏度及準確率均低于FNA，因此也不能滿足臨床診斷甲狀腺結節的需求。

由于檢測到BRAFV600E突變即可診斷為乳頭狀癌，在FNAC基礎上聯合BRAFV600E突變檢測，不會增加假陽性率，兩者特異度無差別。乳頭狀癌在臨床發現的甲狀腺癌中占絕大多數(80%～90%)，提高乳頭狀癌檢出率能間接提高甲狀腺癌的術前檢出率。對于部分病理呈不典型改變、FNAC未作出惡性診斷的結節，可檢測到BRAFV600E突變，那么FNAC聯合BRAFV600E突變檢測與單獨FNAC比較，能提高甲狀腺癌的檢出率(靈敏度)，本研究的靈敏度由75.0%提升至89.1%。且FNAC與BRAFV600E突變檢測均為陽性的患者，術后病理證實準確率為100%。BRAFV600E突變檢測雖然對良性結節診斷無意義，但理論上可通過提高惡性結節的檢出率提升診斷的總體符合率。本研究中準確率比較差異無統計學意義的原因可能與樣本量有限有關，有待進一步探討。

此外，BRAFV600E突變與乳頭狀癌對周圍組織的高侵襲性相關，是中央組淋巴結轉移率的預測因子，還可引起腫瘤細胞對放射性碘的攝取力降低，導致放射性碘治療失敗，是判斷預后的影響因子[8-9]。因此，術前FNAC檢查不但能提高甲狀腺癌的檢出率，還能提示病變的惡性程度，并為預后評估提供依據。

4 結 語

綜上所述，甲狀腺結節細針穿刺檢測BRAFV600E突變方法可靠，與FNAC聯合能提高甲狀腺惡性結節診斷的靈敏度，同時可能有助于篩選出高危甲狀腺癌病例，指導手術方式及術后選擇后續治療方案。

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ZHANG Boming, LIN Yuanqiang, SUI Guoqing, WANG Yang, ZHAO Qianqian, WANG Hui (Department of Ultrasound, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China)

WANG Hui E-mail: wanghui19620708@aliyun.com

Objective:To investigate the application value of fine-needle aspiration cytology (FNAC) combined with BRAF mutation detection in the diagnosis of thyroid nodules.Methods:A total of 87 patients who were diagnosed as suspicious malignant thyroid nodules by ultrasonic examination from June 2014 to June 2015 were selected. All the patients underwent FNAC and BRAF mutation detection by fluorescence polymerase chain reaction (PCR).Results:Among 64 malignant cases, 48 cases were positive and 16 cases were negative for FNAC, and 40 cases had BRAFV600Emutation. Among 23 benign cases, 5 cases were positive and 18 cases were negative for FNAC, and no case had BRAFV600Emutation. Compared with the postoperative pathological results, the sensitivity was 75.0%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 75.9% for FNAC. The sensitivity of BRAF mutation detection was 62.5%, the specificity was 100.0%, and the accuracy was 72.4%. The sensitivity was 89.1%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 86.2% for FNAC combined with BRAFV600Emutation detection.Conclusion:FNAC combined with BRAFV600Emutation detection can improve the sensitivity of diagnosis of malignant thyroid nodules.

R445.1

A

1008-617X(2015)04-0259-05

2015-11-30）

吉林省科技發展計劃項目(No：20130206020SF)

王輝 E-mail：wanghui19620708@aliyun.com

The value of fine-needle aspiration cytology combined with BRAFV600E mutation detection in diagnosis of thyroid nodules